作者：王康，史宏燦，陸世春，孫超，賀建勝，裴昶

【摘要】 對人工血管管壁涂層的生物材料進行生物相容性的實驗評價。按照國際標準，對相關單個和混合材料進行急性全身毒性試驗、熱源試驗、溶血試驗和細胞毒性試驗。 結果表明：本實驗涉及的生物材料膠原蛋白、聚乳酸以及混合組分材料均符合生物相容性評價實驗的安全標準。說明膠原蛋白和聚乳酸作為復合型人工血管管壁涂層材料具有生物相容性和安全性，可為臨床產品的研制提供依據。

【關鍵詞】 人工血管涂層材料；生物材料；生物相容性；膠原蛋白；聚乳酸

Abstract：To make evaluation far biocompatibility of the materials which is covered on the vascular prosthesis surface.With the international standardizations， some experiments for the materials were done， include acute systemic toxicity test ， pyrogen test ，hemolysis test and cytotoxicity test.Results showed that the collagen protein，L-polylactic acid and the mixed materials were all consistent with the safety control.It proves that the collagen protein and L-polylactic acid are with biocompatibiliy and safety for coating on the surface of vascular prosthesis.

Key words：Converage of vascular prosthesis; Biomaterial; Biocompatibility;Collagen protein; L-polylactic acid

1 引 言

人工血管主要與血液接觸，因此生物材料的血液相容性是最關鍵的問題。另外，蛋白質［1］、粒-單系細胞［2］、補體和細胞因子［3］等對于生物材料的相容性也有一定程度的影響。表面特性對于接觸血液形成血栓的影響最為關鍵，例如外形、表面粗糙程度、可濕性、親水性等［4］。此外，血液的流態影響也是血栓形成的一個方面。尋找兩個方面彼此適應的契合點被認為是最好的解決方法。因此，表面涂層技術被運用于改善人工血管的生物相容性。將材料表面覆蓋上一層其他生物相容性好的物質，將材料與體液環境分隔開，避免接觸，從而達到減少甚至避免排斥反應。

2 試驗方法

試驗所有標準均符合《醫療器械生物學評價》GB/T 16886.1—1997國家標準相關規定。膠原蛋白由黑龍江衛世醫藥有限公司提供，L聚乳酸由濟南健寶開元生物材料有限公司提供。混合材料制備方法：將液狀膠原蛋白與聚乳酸等體積混合，充分均勻攪拌，置4℃冰箱中凝固成固體狀備用。

2.1 急性全身毒性試驗

2.1.1 試驗原理 將試驗材料或材料浸提液通過動物靜脈或腹腔注射到動物體內，觀察動物的生物學反應，以判定材料的急性毒性作用。

2.1.2 材料浸提液 將受試材料制成20 mm×10 mm、厚1 mm的立方體長條薄片。按照浸提介質：試樣表面積=1 m1：3 cm2制成，浸提介質為0.9%生理鹽水，浸提條件為37℃，72 h。0.22 um的微孔濾器滅菌，4℃冰箱保存備用。陰性對照采用0.9%生理鹽水。

2.1.3 實驗動物 選取體重20～27 g的健康昆明系小鼠，雌雄分籠同養，分六個實驗組，每組5只。

2.1.4 實驗方法 （1）浸提液及陰性對照液，置于37℃恒溫水浴箱中復溫。（2）將浸提液以及對照液按50 ml/kg劑量由小鼠尾靜脈緩慢注入。

2.1.5 評價方法 記錄注射后實驗動物在24 h， 48 h， 72 h的體重變化，觀察其一般狀態、毒性表現及死亡情況。材料毒性程度根據中毒癥狀分為無毒、輕度毒性、中度毒性、重度毒性和死亡。所有數據均采用SPSS10.0統計學處理系統軟件進行數據分析，統計學處理采用t檢驗。

2.2 熱源試驗

2.2.1 試驗原理 將材料浸提液由耳緣靜脈注入家兔體內，在規定時間內觀察家兔體溫升高情況，以判斷浸提液中所含熱源的限度是否符合規定。

2.2.2 材料浸提液 將材料制成10 mm×20 mm、厚1 mm方形薄片。按浸提介質：試樣表面積=lml：3 cm2制成，浸提介質為0.9%生理鹽水，浸提條件為37℃，72 h。0.22 um的微孔濾器滅菌。陰性對照采用0.9%生理鹽水。

2.2.3 實驗動物 健康新西蘭大白兔，2.3～2.8 kg，雌雄不限，3只為一實驗組。

2.2.4 實驗方法 (1)將肛門體溫計插入家兔肛門，深度約6 cm，時間約3 min；試驗前禁食2 h，間隔30 min分別測3次體溫，取其平均值為正常體溫值。(2)材料浸提液37℃恒溫箱預熱后，沿耳緣靜脈緩慢注入，劑量為10 ml/kg。(3)注射后每隔l h測量1次，共測3次，以3次中體溫最高值減去正常體溫，即為體溫升高度數。

2.2.5 評價標準 如果每一實驗組體溫升高均在0.6℃以下，且體溫升高總數在1.4℃以下，可認為試驗材料浸提液符合熱源檢查要求；如每一實驗組中體溫升高≥0.6℃的動物數超過1只，或在復試的3只兔中，體溫升高≥0.6℃動物數仍有1只或以上；或初、復試體溫升高總數超過3.5℃，則認為材料浸提液不符合熱源檢查要求。

2.3 溶血試驗

2.3.1 試驗原理 通過試樣材料或其浸提液在體外與動物血液直接接觸，根據測定紅細胞釋放的血紅蛋白量來評價該材料是否對紅細胞的功能和代謝造成不良影響，對材料是否具有溶血反應進行客觀評價。

2.3.2 實驗動物及材料 健康新西蘭兔1只，體重2.57 kg。陰性對照采用0.9%生理鹽水，陽性對照采用蒸餾水。

2.3.3 實驗方法 (1) 將試樣材料制成2.5 cm×2 cm小條狀，置于生理鹽水40 ml中，置37℃恒溫水浴箱中保溫30 min。（2）試樣組、陽性、陰性對照組各設平行樣品試管5個，每管加相應浸提液4 ml。(3) 將肝素一支（12 500U）溶于50 ml生理鹽水中，使用時按照1 ml血配25U肝素的比例使用。（4）心臟采兔血20 m1，加入2%肝素1 ml，制成新鮮抗凝血，然后按新鮮抗凝血：生理鹽水=4：5的比例制成稀釋兔血。(5) 每試管加稀釋兔血0.2 m1，混勻，37℃恒溫水浴箱保溫60 min。（6）所有試管經1 500 rpm，離心5 min，取上清在545 nm波長測其吸光度。

2.3.4 評價方法 溶血率(%)=(試樣組吸光度一陰性組吸光度)/(陽性組吸光度一陰性組吸光度)×100%。評判標準：陰性對照管吸光度＜0.03，陽性對照管吸光度為0.8±0.30時實驗結果有效，當溶血率≤5%時，可判斷該材料不具溶血作用。

2.4 細胞毒性試驗

2.4.1 試驗原理 利用細胞體外培養的方法來評價醫用材料及裝置或其浸提液可濾出成分中潛在性的細胞毒性。

2.4.2 實驗方法 (1)細胞形態觀察法 將不同受試材料以及陽性、陰性參照材料分別置于培養皿內，然后加入5×104/ml的L-929細胞懸液3 m1于培養皿內，每組設平行樣品5個，加入新鮮培養液，放入37℃，5%CO2培養箱內培養。培養過程中定時通過倒置顯微鏡觀察受試材料表面及邊緣的細胞，根據其形態和生長狀況把毒性分級分為無毒，輕度、中度、重度毒性。

(2)MTT比色法 取96孔培養板，加入5×104/ml L-929細胞懸液100 u1/孔，開放培養。24 h后，每孔加入試樣浸提液100 ul，空白對照組加入100 ul新鮮培養液。置37℃，5%CO2培養箱內分別連續培養2 d、4 d和7 d。觀察時，每孔加入MTT (5mg/ml) 50 u1，繼續培養至6 h后，棄原培養液，加入DMSO 150u1/孔，室溫輕度振蕩15 min。使用酶聯免疫測定儀測試其吸光度值。測試波長為490 nm，參考波長為550 nm。計算細胞相對增值率(relative growth rate，RGR)=實驗組吸光度均值/空白對照組吸光度均值)×100%。然后根據6級毒性評分標準轉換成毒性分級(0-5級)：大于100%為0級，75%～99%為1級，50%～74%為2級，25%～49%為3級，1%～24%為4級，0為5級。

3 試驗結果

3.1 急性全身毒性試驗

所有實驗小鼠均無死亡，活動、進食及大小便均正常，精神狀態良好，無驚厥、抽搐、癱瘓、呼吸抑制等毒性反應。不同觀察時間內動物體重均有一定程度的增加，但是在正常范圍之內（見表1）。結果陰性對照組比較未見明顯差異(P＞0.05)，表明兩種受試材料均屬無毒級生物材料。表1 急性全身毒性試驗小鼠體重增加結果

3.2 熱源試驗

結果見表2。各試驗組動物注射材料浸提液后，體溫升高均在0.6℃以下，且溫度升高總數在1.4℃以下，符合熱源檢測有關規定，表明受試材料及其浸提液不含致熱源物質，材料植入體內后無熱源作用。表2 人工血管涂層材料試樣熱源試驗結果

3.3 溶血試驗

結果見表3。本實驗中，試樣管離心后上層均為清亮無色液體，下層為紅細胞沉淀物，涂片鏡檢未見紅細胞破裂或凝聚。陰性對照管的吸光度小于0.03，陽性對照管吸光度在0.8±0.3范圍內，符合國家標準。根據非直接接觸血液的醫用生物材料性能測試所提出的溶血率小于5%標準，判定兩種受試材料體外試驗不引起溶血反應。 表3 人工血管涂層材料試樣溶血試驗結果

3.4 細胞毒性試驗

3.4.1 細胞形態觀察 見圖1、圖2、圖3、圖4、圖5。

3.4.2 MTT法 試樣材料MTT法檢測結果見表4、表5、表6。表4 MTT法培養2天的試驗結果表5 MTT法培養4天的試驗結果 表6 MTT法培養7天的試驗結果

4 討論

急性全身毒性試驗是一種非特異性急性毒性試驗。本實驗采用小鼠腹腔注射途徑，結果顯示，72 h內所有實驗組小鼠均無死亡，活動正常，精神狀態良好，沒有毒性反應。與陰性對照組比較沒有明顯差異（P＞0.05 )，表明兩種材料均屬無毒級的生物材料，而且材料混合后也沒有產生另外的毒性物質，符合生物材料的安全性標準。

生物材料在制備過程中可能殘留的單體、輔助添加劑或被內毒素污染等都會含有致熱源物質，在植入體內后會引起恒溫動物體溫的異常上升。熱源試驗［5］過程中應該盡量杜絕室溫，注射液溫度，驚嚇等影響因素對實驗結果的干擾。本實驗結果表明，兩種材料均不含致熱源物質；并且組份材料混合后也未產生新的致熱源物質。

溶血試驗［6］可以作為體外細胞毒性試驗的一個重要補充。如果材料有溶血作用，則提示材料可能具有細胞毒性。實驗結果表明，陰性對照管的吸光度小于0.03，陽性對照管吸光度在0.8士0.3范圍內，符合國家標準。兩種材料溶血率分別為0.20%、0.18%，混合材料組的溶血率為0.15%，均符合醫用生物材料的應用要求。可以認為這兩種材料沒有溶血作用。

細胞毒性是指利用生物材料及其浸提液與細胞進行體外培養的方法來評價醫用材料及裝置或其浸提液可濾出成分中潛在性的細胞毒性。目前，幾乎所有的生物材料都必須通過相關試驗檢測其是否具有細胞毒性。聚全氟乙丙烯是已知并通過實驗論證的無毒聚合材料，已經被廣泛應用于醫療用品的生產制備，本實驗作為陰性對照材料；聚氯乙烯則為已知有毒材料，本實驗用作陽性對照材料。從圖1～5可以看出，兩種材料以及混合材料組的細胞形態均正常，貼壁生長良好，與陰性對照組無明顯差別；而陽性對照組中大部分細胞變成圓形，胞核固縮，凋亡細胞明顯增多，材料表面細胞稀少，基本不貼壁。根據已知的細胞形態分析標準，人工血管兩種涂層材料均不具備細胞毒性。

MTT比色法的生物學終點是線粒體活性的檢測。細胞生命活動旺盛時，線粒體數量就增多，衰退時則減少。本實驗中我們發現，聚乳酸組L-929細胞在體外共同培育時，2 d、4 d時細胞毒性均為1級，RGR分別為88.61%和95.7%，而在7 d時細胞毒性評級［7-8］就轉評為0級，并且RGR處于逐漸升高狀態，這種現象可能與隨著培養時間的延長，輕度受損后的細胞其活力得到一定的恢復有關。膠原蛋白、混合材料和聚全氟乙丙烯與L-929細胞在體外共同培育時，細胞毒性評級一直處于0級水平。陽性對照組的細胞RGR在培育期間呈逐漸下降趨勢，其細胞毒性分級在2 d時為1級，而在4 d為2級，7 d時則增加到3級。試驗結果表明，兩種受試材料表現出了良好的細胞相容性。

5 結論及展望

隨著心臟血管外科技術的成熟與發展，處理好生物材料在體內生物相容性的問題，會對新材料的研制和開發產生重要的影響。