作者：趙領洲，張玉梅，魏艷萍，李健學

【摘要】 目的：觀察微弧氧化（MAO）方法對近β鈦合金Ti5Zr3Sn5Mo15Nb（TLM）表面處理后對成骨細胞早期行為的影響. 方法：用脈沖直流電源在兩個不同電壓下對TLM表面進行微弧氧化處理，并用電鏡觀察試樣表面形貌. MTT方法檢測成骨細胞增殖，用商業試劑盒檢測總蛋白合成及堿性磷酸酶（ALP）活性. 結果：微弧氧化處理可以在TLM表面形成一層多孔生物活性氧化層，其形貌與微弧氧化電壓有關，低電壓時形成的孔洞結構較小，高電壓時形成的孔洞結構較大. 成骨細胞在微弧氧化表面的早期增殖（24，72，120 h）及7 d細胞總蛋白合成明顯高于拋光表面，且細胞在高電壓微弧氧化表面的增殖優于低電壓表面. 而培養7 d后微弧氧化表面的細胞ALP活性明顯低于拋光表面，且高電壓表面的最低. 結論：微弧氧化處理改變了TLM表面形貌以及其它特性，從而促進成骨細胞在其表面的增殖及合成分泌活性，但抑制其ALP活性. 不同電壓下形成的不同微弧氧化形貌對成骨細胞的早期行為有影響.

【關鍵詞】 鈦合金；微弧氧化；表面特性；成骨細胞

0引言

目前，廣泛應用于臨床的純鈦和Ti6Al4V種植體材料中存在著鋁（Al）和釩（V）的潛在毒性及彈性模量太大易造成界面應力屏障等問題. 為此，我們開發了一種不含Al和V的近β鈦合金Ti5Zr3Sn5Mo15Nb（TLM），其彈性模量較純鈦和Ti6Al4V低，并且其彈性模量、強度及可塑性等機械性能匹配優于其它報道的β鈦合金［1］，有希望成為新一代骨植入材料. 體外細胞與種植材料的相互作用在一定程度上可以反映材料的生物活性. 細胞對材料的反應受到材料表面性質影響，目前普遍認為粗糙的表面形貌有利于促進細胞的生物學反應［2］. 微弧氧化（MAO）方法可以在材料表面生成一層多孔粗糙且與基底緊密結合的氧化膜，有利于改善種植體表面生物相容性［3］，而微弧氧化膜的表面特性如孔隙大小、孔隙率及粗糙度等可通過微弧氧化參數如電壓等來控制調節. 我們采用兩個不同的電壓對TLM進行微弧氧化處理，觀察不同形貌對成骨細胞早期增殖、總蛋白合成及堿性磷酸酶（ALP）活性的影響.

1材料和方法

1.1材料TLM圓片（直徑14.5 mm，厚度1 mm；西北有色金屬研究院）；微弧氧化電源MAO100（西安交通大學金屬材料強度國家重點實驗室）；DMEM培養基（Gibco公司）；新生牛血清（Gibco公司）；MTT（Solarbio公司）；蛋白測定試劑盒和ALP測定試劑盒（北京中生北控生物科技股份有限公司）；24/96孔培養板（Costar公司）；掃描電子顯微鏡（日本，JSM6460）.

1.2方法

1.2.1試樣制備及試樣形貌觀察TLM圓片表面用碳化硅砂紙400號至1200號順序拋光. 微弧氧化處理之前試樣依次采用丙酮超聲清洗15 min，去離子水30 min，空氣干燥. 微弧氧化電解液含有0.04 mol/L βGP（C3H7Na2O6P·5H2O)和0.2 mol/L CA(C4H6CaO4·H2O)，電源頻率100 Hz，占空比20%，處理時間5 min. 根據MAO所采用電壓不同，試樣分為3組：P：拋光組，作為對照；MAO300組：微弧氧化最終電壓為300 V；MAO450組：微弧氧化最終電壓為450 V. 試樣在用于實驗之前依次用丙酮、無水乙醇、750 mL/L乙醇及去離子水各超聲清洗20 min，131℃高壓蒸汽消毒30 min. 采用掃描電子顯微鏡觀察試樣表面形態，工作電壓20 kV.

1.2.2細胞培養成骨細胞由胰酶膠原酶連續消化新生1 d大鼠頭蓋骨獲得. 機械方法輕柔地去除頭蓋骨表面及骨縫處的軟組織. 為了降低成纖維細胞污染，骨片先用胰酶消化90 min并棄上清. 細胞培養液為DMEM，100 mL/L新生牛血清、10 mL/L青霉素、10 mL/L鏈霉素. 成骨細胞表型由ALP及礦化結節染色驗證. 37℃， 50 mL/L CO2濕潤條件下培養， 2～5代用于細胞實驗.

1.2.3細胞增殖實驗試樣放在24孔培養板內，每組試樣隨機選3個樣本. 細胞接種密度為2×104/孔，細胞培養液為1 mL. 細胞培養24，72，120，68 h后終止細胞培養，PBS漂洗2次，每孔加入5 g/L MTT 200 μL和800 μL無血清無酚紅DMEM. 37℃孵育4 h后吸棄上清，加入1 mL DMSO溶解生成的結晶物，每孔取3份200 μL 溶解液轉移到96孔培養板，測A490 nm值.

1.2.4細胞總蛋白合成測定試樣放置和細胞接種同細胞增殖實驗. 細胞培養7 d后吸棄培養液，PBS漂洗2次. 每孔加入蒸餾水1 mL，3個凍融循環裂解細胞. 每孔取3份100 μL細胞裂解液轉移到96孔培養板，空白孔加100 μL生理鹽水，3個標準孔各加入100 μL標準蛋白（70 g/L），然后各加入200 μL蛋白測定試劑，37℃孵育30 min. 空白孔調零，測A570 nm值，總蛋白濃度=A570 nm樣品/A570 nm標準×標準蛋白濃度，結果用7 d 的MTT A490 nm值標準化.

1.2.5細胞ALP活性測定采用細胞總蛋白合成測定的同一細胞裂解液測量細胞ALP活性. 每孔取3份100 μL細胞裂解液轉移到96孔培養板，空白孔加入100 μL蒸餾水，然后各加入150 μL ALP測定工作液（使用前先37℃預保溫10 min），37 ℃反應30 min后加入50 μL 1 mol/L NaOH終止反應. 空白孔調零，測A570 nm值并用細胞總蛋白合成標準化.

統計學處理: 采用SPSS 11.0統計軟件進行數據處理，用方差分析和SNK檢驗比較組間差別，取α=0.05.

2結果

2.1試樣表面形貌試樣的表面形貌如圖1所示，拋光表面可見沿拋光方向平行排列的溝槽，并可見散在于表面的金屬薄片. 微弧氧化后表面溝槽消失，形成多孔結構，由均勻分布的火山口樣突起相互連接組成，突起中央有孔洞存在. 當電壓為300 V時，孔洞直徑約0.2～2.5 μm；當電壓升高到450 V，突起及孔洞的尺寸均增大，孔洞直徑約1.0～7.0 μm，而孔隙率較300 V時低.

2.2成骨細胞在試樣表面的增殖大鼠成骨細胞在TLM表面的增殖結果如圖2所示. 在24 h和72 h，成骨細胞在微弧氧化表面的增殖均顯著高于拋光表面（P<0.05）. 到120 h時，高電壓微弧氧化表面細胞增殖仍顯著高于拋光表面（P<0.05），低電壓表面細胞增殖低于拋光表面但無統計學差異. 當培養168 h后，微弧氧化表面的細胞增殖數目與拋光表面的無統計學差異. 在24，120，168 h時，高電壓微弧氧化表面的細胞增殖均明顯高于低電壓微弧氧化表面（P<0.05）. 從24 h至120 h，成骨細胞增殖迅速，而到168 h時成骨細胞增殖速度開始減慢.

2.3成骨細胞的總蛋白合成成骨細胞在不同TLM表面培養7 d后的細胞總蛋白合成用7 d MTT A490 nm值做標準化. 結果表明兩個微弧氧化TLM表面的細胞總蛋白含量均顯著高于拋光表面（P<0.05），不同電壓微弧氧化表面細胞總蛋白無明顯差異.

2.4成骨細胞的ALP活性成骨細胞的ALP A570 nm值用細胞總蛋白合成做標準化. 成骨細胞在不同TLM表面培養7 d后的ALP活性均明顯低于拋光表面（P<0.05），高電壓微弧氧化表面的細胞ALP活性明顯低于低電壓微弧氧化表面（P<0.05）.

3討論

微弧氧化是一種在種植體表面形成多孔粗糙氧化層的理想的方法，而且該氧化層的形貌特征和粗糙程度可以通過調節電壓等微弧氧化參數來改變. 微弧氧化膜的多孔結構是由于隨著微弧氧化過程的進行，基體表面的氧化層越來越厚，于是局部出現微弧放電，擊穿表面的絕緣氧化層而形成［4］. 隨著微弧氧化最終電壓的升高，微弧放電越劇烈，從而使得表面孔洞直徑以及粗糙度更大. 而且伴隨著TLM表面形貌的改變和粗糙度的提高，其它的一些與形貌和粗糙度相關的表面特性也有變化，如TLM的表面潤濕性和表面能也有所提高，且與微弧氧化電壓呈正相關關系.

細胞在材料表面的增殖受材料表面性質的影響. Kunzler等［2］報道大鼠頭蓋骨成骨細胞隨著表面粗糙度增加增殖率明顯增加. 材料表面高濕潤性及高表面能也會促進細胞的增殖［5］. 我們的實驗中，成骨細胞在微弧氧化TLM表面的早期增殖優于拋光表面，而且細胞在高電壓微弧氧化表面的增殖優于低電壓微弧氧化表面. 該結果與以前報道的規律是一致的，因為微弧氧化處理提高了TLM表面粗糙度及與粗糙度相關的表面潤濕性和表面能，且這些效果與微弧氧化電壓正相關. 我們還觀察到細胞的早期增殖速度較快，而到168 h時細胞增殖速度開始減慢. 原因可能是培養168 h后試樣上的細胞開始接觸融合，從而出現接觸抑制現象.

成骨細胞的總蛋白合成具有重要意義，它提示細胞在材料表面的健康生長和正常的細胞反應. 本實驗中的總蛋白合成用MTT A490 nm值做了標準化，代表細胞的合成和分泌活性. 細胞的合成和分泌活性對材料的表面特性比較敏感［6］. 但關于材料表面特性對細胞總蛋白合成影響的報道不一，有報道不同特性表面的總蛋白合成無差異［7］，也有報道光滑表面的總蛋白合成較低［8］. 我們的實驗結果與后者相似，TLM表面微弧氧化處理后促進成骨細胞的合成和分泌活性，但不同電壓微弧氧化表面之間效果無差異. 造成各實驗報道差異的原因尚不清楚，所使用的細胞來源不同以及所使用的實驗方法不同可能是其原因之一.

ALP活性是成骨細胞分化的一個重要標志，目前普遍接受的觀點認為材料表面粗糙度的增加會促進細胞分化，而且也有報道微弧氧化純鈦促進人骨肉瘤細胞ALP活性 ［4］. 我們的結果與此相反，TLM微弧氧化后粗糙度增大，但成骨細胞的ALP活性卻受到抑制. Zhu等［3］的實驗結果卻是微弧氧化表面的細胞ALP活性與對照組無統計差異. 由此可見，關于材料表面特性對細胞分化的影響還存在分歧，我們的實驗中微弧氧化TLM表面成骨細胞ALP活性降低的具體原因還需進一步實驗探索.

綜上所述，微弧氧化處理可在TLM表面形成一層多孔粗糙的氧化層，且該氧化層的特性如孔洞直徑和粗糙度隨微弧氧化電壓的升高而增大. 微弧氧化處理促進成骨細胞在TLM增殖及合成和分泌活性，但抑制成骨細胞的ALP活性，且高電壓微弧氧化表面促進增殖和抑制ALP活性作用更明顯. 其中微弧氧化促進成骨細胞合成分泌活性和抑制其ALP活性的具體機制有待研究.

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