作者：李國臣 王林 桑宏勛 李祥 王成燾 黃鑫 雷偉 姥偉

【摘要】 [目的]探討可控微結構EBM鈦合金支架作為成骨細胞體外培養載體的可行性，并觀察載體類蜂巢狀孔結構在成骨細胞培養中的作用。[方法]應用直接金屬快速成形技術—電子束熔化成形(electron beam melting，EBM)過程直接構建和制備可控性微結構鈦合金支架。分離培養1 d齡胎兔顱骨成骨細胞，以兔顱骨源性成骨細胞復合支架作為實驗組，以單獨培養的兔顱骨源性成骨細胞作為對照組。將成骨細胞與支架復合培養1、7、14 d后，進行倒置相差顯微鏡、掃描電鏡及組織切片染色觀察細胞與材料復合情況，以MTT比色法及堿性磷酸酶的定量檢測研究材料結構對細胞增殖、分化的影響。[結果]成骨細胞/支架復合培養7 d后，大量細胞通過伸出多個偽足粘附在支架表面以及孔周圍并與支架牢固結合;培養14 d后支架表面及孔隙內有大量細胞分布，細胞伸出數個突起沿著孔隙壁逐漸向孔隙內延伸、匯集。支架上的細胞增殖、分化以及轉移明顯增加，與對照組比較有明顯統計學差異(P<0.05)。 [結論]EBM鈦合金支架有利于細胞的貼附、生長及增殖，并對細胞的功能無不良的影響。支架類蜂巢狀孔結構能夠調節成骨細胞在支架內的分布。

【關鍵詞】 組織工程; 支架; 鈦合金; 多孔結構

Abstract：[Objective]To explore the feasibility of culturing osteoblast on titanium alloy scaffold with controlled internal structure fabricated using electron beam melting techniques in vitro and to investigate the effects of likehoneycomb scaffold with controlled porous structure.[Method]A direct metal rapid prototyping(RP) fabrication technique，electron beam melting (EBM) process，was utilized to fabricate porous titanium alloy scaffold with fully interconnected and controlled internal pore structure.Osteoblasts were isolated from rabbit skulls，seeded on scaffolds，and cultured for up to 1，7 and 14 days respectively.The experiment was pided into experiment group(cells cultured with scaffold) and control group (cells alone ).The growth of rabbit osteoblast on the scaffolds was observed by inverted phase contrast microscope，scanning electron microscope，and histological section staining method.Proliferation and differentiation of osteoblasts were determined at different time points by MTT assay and the activity of alkaline phosphatase.[Result]The results showed the osteoblasts on scaffolds grew well in vitro with biological and morphological characteristics similar to those of normal osteoblasts.Good adhension，proliferation and differentiation of the osteoblasts on the scaffold were noted with the culture time prolonged.The number of cells on scaffolds was higher than the control group (P<0.05).[Conclusion]The porous scaffold not only has good biocompatibility，but also improved the adhesion，growth and proliferation of osteoblasts，showing no adverse effects on the cell functions.The controlled likehoneycomb pore structure can adjust the distribution of osteoblasts on the scaffolds.

Key words：tissue engineering; scaffold; titanium alloy; porous structure

金屬材料廣泛的應用于骨科和牙科移植物，因其與天然材料、高分子材料、無機材料及它們的復合材料相比具有較高的機械特性和延展特性而應用于承重部位骨缺損的修復和重建。近幾年，可控的三維多孔金屬支架結構的潛在研究引起了組織工程研究者的關注，例如鈦金屬[1、2]、鉭金屬[3]等。然而在眾多金屬生物材料之中，鈦金屬因其具有良好的機械特性、生物相容性、生物安全性、良好的抗腐蝕性能等而被廣泛的應用。我們利用快速成形制造技術和電子束熔化成形技術設計并制備可控性微結構鈦合金支架，通過對支架與成骨細胞的生物相容性進行評價來探討該支架作為成骨細胞載體的可行性，以及載體微結構在培養中的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及主要試劑和儀器

健康1 d齡新西蘭大白胎兔2 只，體重及雌雄不限，由第四軍醫大學實驗動物中心提供;DMEM培養基(Gibco BRL公司，美國);新生牛血清(杭州四季青公司);成骨誘導培養液、磷酸對硝基苯酯ALP檢測ELISA系統、對硝基苯酚、胰蛋白酶、MTT、DMSO、細胞培養瓶、培養板(Sigma公司，美國);掃描電子顯微鏡(HITACHI S-3000N，日本);倒置顯微鏡(Olympus 公司，日本);Leica SP1600鋸式切片機(德國);Penguin 600CL圖像采集系統(美國)。

1.2 可控性微結構EBM鈦合金支架的設計與制備

支架材料由上海交通大學機械工程學院制備和提供，其制造基本原理是采用快速成形技術及電子束融化成型技術對金屬的直接制造。支架是一種鈦合金材料，其中鋁(A1)的質量百分比為6%、釩(V)的百分比為4%、其余為鈦。支架的外部形狀為圓柱狀，直徑11.6 mm，高度5.0 mm(圖1a);支架的內部形狀為類蜂巢狀結構，孔與孔之間彼此相互連通并且貫通于支架的外表面，孔與孔之間的連接桿寬度500 μm，支架平均孔徑約為1.05 mm(圖1b)。支架為孔隙率65%的均質多孔性能，體積重量比為4.42 g/cm3，抗壓強度為110 MPa，彈性模量為2.7 GPa。支架在使用前經高溫高壓蒸汽滅菌處理。

1.3 細胞的分離與擴增

基礎培養液為DMEM高糖培養基，含體積百分比為10%的新生牛血清、青霉素(100 u/ml) 、鏈霉素(100 u/ml);成骨誘導培養液為基礎培養液中加入β-甘油磷酸鈉(10 mmol/L)、地塞米松(10 nmol/L)、L-抗壞血酸(50 μg/L)。采用改良的胰蛋白酶消化-組織塊法[4]分離、擴增兔成骨細胞。取1 d齡新生新西蘭白兔，雌雄及體質量不限，清潔飼養，取顱骨，去除結締組織，PBS沖洗，切成1～2 mm2大小組織塊，經質量百分比為0.25%的胰蛋白酶37 ℃下消化10～15 min后排列于培養瓶底，倒置培養4 h后翻轉培養瓶，添加基礎培養液，隔2 d換液，細胞匯合后傳代。細胞傳至第3代以備用。

1.4 細胞接種與培養

支架經洗滌，高溫高壓消毒，烘干后放入24孔培養板內，添加基礎培養液(含10%新生牛血清、100 u/ml青霉素、100 u/ml鏈霉素、2.5 ug/ml的兩性霉素B)至浸沒支架，放置于5%CO2、37℃的培養箱內孵育24 h后吸盡培養液，將第3代成骨細胞制成1×106/ml懸液，按支架孔隙容積分3次并間隔5 min滴入支架頂面。培養箱內孵育2 h后，每孔添加2 ml基礎培養液，24 h后換用誘導培養液，隔2 d換液。

1.5 檢測指標

1.5.1 形態學觀察 倒置相差顯微鏡下觀察成骨細胞形態變化。

1.5.2 兔顱骨成骨細胞的鑒定 采用改良Gomori鈣-鈷法進行細胞內ALP染色以鑒定成骨細胞，將第3代成骨細胞以1×106個/孔的密度接種6孔板中，取培養7、14 d的細胞爬片，10%中性甲醛固定15 min，改良Gomori鈣-鈷法染色觀察。以蒸餾水替代底物β-甘油磷酸鈉的孵育液為空白對照。

1.5.3 MTT法檢測細胞增殖活性 細胞接種及培養1、7、14 d后每組取出5個孔，按照2 ml/孔加入MTT溶液(5 mg/ml)，37℃繼續孵育4 h后終止培養并吸棄孔內培養上清液。加入DMSO 2 ml/孔，震蕩20 min，使紫藍色結晶物充分溶解。溶液按照100 ul/孔加入96孔板，每個樣品6孔。用酶聯檢測儀在490 nm波長處檢測各孔吸光度值(A)，重復檢測3遍，取6孔的均值代表一個樣本的A值。同時以細胞直接接種于培養板底部作為對照，結果進行統計學分析。

1.5.4 掃描電子顯微鏡(SEM)觀察 細胞支架復合物分別培養1、7、14 d后，經PBS沖洗，支架經3%戊二醛溶液4℃下固定24 h、PBS沖洗、梯度乙醇溶液(80%～100%)脫水、真空干燥、噴金處理后于SEM下觀察并拍攝照片。

1.5.5 細胞堿性磷酸酶(alkaline phosphate，ALP)活性定量檢測 細胞懸液計數后按1×106 /孔接種于96孔板中，每個樣本接種6孔。加人體積百分比為1% 的Trit0nX-100 4℃過夜裂解細胞，使ALP進入溶液中。ALP檢測：采用磷酸對硝基苯酯ALP檢測ELISA系統，以從1 000 μmol/L原溶液中倍比稀釋得到的濃度為0～250 μmol/L對硝基苯酚為標準底物繪制標準曲線，主要步驟：取80 μL檢測樣品或標準底物，加入96孔板內，再加入120 μL磷酸對硝基苯酯;室溫下避光孵育30 min后每孔加入NaOH 50 μl終止反應。酶標儀405 nm波長檢測各孔吸光度值(A值)，每孔樣本重復檢測3次后計算平均A值，并根據標準曲線換算為單個細胞ALP含量。

1.5.6 組織學染色和觀察 支架經10%甲醛常溫固定7 d后，梯度乙醇(80%～100%)脫水、二甲苯透明后用甲基丙烯酸甲酯(MMA)包埋。包埋塊用Leica SP 1600鋸式切片機沿支架的冠狀軸切片，切片厚度為150 μm，將切片研磨至50 μm，再經三氧化二鋁粉(3 μm)拋光后，全部切片均行蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin stain，HE)染色、顯微鏡觀察、圖像采集系統取圖。

1.6 統計學分析

采用SPSS 13.0 統計軟件包進行分析。數據以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析和t 檢驗，P<0.05為有統計學意義。

2 結 果

2.1 成骨細胞形態學觀察及鑒定

采用改良的酶消化-組織塊法培養的兔成骨細胞，組織塊貼壁6 d后成骨細胞自骨塊邊緣爬出(圖2a)，培養10 d后傳代，傳代第3 d時，細胞呈貼壁生長，主要為梭行或多角型并帶有數個突起(圖2b);傳代第6 d時，細胞融合成片，分界變得較為模糊，胞體增大并呈層疊生長而不出現接觸抑制現象。

改良Gomori鈣-鈷法檢測顯示：原代細胞培養的前5 d，ALP 染色陽性率較低，當細胞逐漸融合后ALP活性增強。取70%～80%融合的原代、1 、2 代細胞，經改良Gomori鈣-鈷法染色，大部分細胞呈陽性，表現為細胞胞漿內可見灰、黑色顆粒(圖2c)，而空白對照組呈陰性。

圖1a 支架大體照片 (×5) 圖1b 支架掃描電鏡圖像(×20) 圖2 1 d齡胎兔原代、第2代成骨細胞形態學觀察及其鑒定(倒置相差顯微鏡×50) 圖2a 原代細胞培養第4 d 圖2b 第2代細胞培養第2 d 圖2c 第2代細胞ALP染色

2.2 細胞活力測定

細胞活力代表了粘附在支架上的活細胞數量，可間接反映細胞增殖情況。本實驗中將細胞活力表達為單位質量的(g)支架的A值。隨著培養時間的延長，兩組A值均升高，相同時間點兩組細胞增殖統計比較，1 d組無統計學差異(P>0.05)，7、14 d組有顯著差異(P<0.05)，有統計學意義;分別比較對照組和實驗組各時間點的差別，有統計學差異(P<0.05)。結果表明支架對成骨細胞增殖有促進作用。結果見表1。表1 兩組各時間點細胞增殖MTT法檢測結果

2.3 SEM觀察

鏡下：細胞支架復合物培養1 d后，在材料表面可見一些形態多樣(以梭形和多角形為主)單層結構的細胞，細胞伸出數個偽足附著于材料內壁，細胞貼附良好但尚未完全伸展，同時在孔洞中也有部分細胞生長(圖3a)。培養7 d后，大量的扁平狀細胞通過伸出多個偽足貼附于支架表面及孔壁并與材料牢固結合，細胞在支架表面及孔內壁完全伸展，幾乎覆蓋所有的材料內壁表面，細胞間排列緊密，可見相鄰細胞的間隔及細胞分泌的絮狀細胞外基質(圖3b)。隨著培養時間的延長，培養14 d后，細胞為多層結構，支架表面覆蓋有密集排列、匯合生長的細胞層并向支架內部移行，撥開細胞層，能看到部分細胞覆蓋支架孔;支架內部，細胞貼附管道內壁生長且成骨細胞跨越微孔表面呈方向性密集排列并向孔隙內分裂增殖。在支架的內表面，細胞從一個孔貫穿到另一個孔(圖3c)。支架表面及內部的細胞形態、密度基本一致。

2.4 ALP活性檢測

隨著培養時間的延長，細胞ALP含量升高，實驗組培養1 d后略高于對照組，差異無統計學意義(P>0.05);實驗組培養7、14 d后ALP含量顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。結果見表2。表2 不同時間兩組單個細胞ALP含量* 與對照組比較P< 0.05

2.5 組織學觀察

細胞支架復合物體外培養1 d后，低倍鏡下不容易觀察到細胞，僅能看見少量細胞聚集形成的輪廓貼附在支架邊緣;高倍鏡下可見成骨細胞多呈單層結構，扁平型或梭形，核圓，著色深藍，排列稀疏，細胞單個或聚集成一小簇粘附在支架的表面，與支架表面貼附良好(圖4a);隨著培養時間的延長，細胞支架復合物體外培養7 d后，成骨細胞出現明顯的分層生長，細胞與支架表面牢固結合，在支架周圍進行增殖，并向孔隙內延伸(圖4b);培養14 d后，細胞數量明顯增多，呈多層結構，以支架表面為支撐點，在孔隙附近連接成片向微孔內成簇生長(圖4c)。

圖3 細胞與支架體外復合培養1、7、14 d掃描電鏡觀察(×50) 圖3a 復合培養1 d 圖3b 復合培養7 d 圖3c 復合培養14 d 圖4 支架與細胞體外培養1、7、14 d硬組織切片 HE染色(×200)

3 討 論

關于骨科金屬支架的最主要的問題是骨組織和大塊金屬生物材料之間的彈性模量的不匹配，由于機械特性的不匹配致使骨組織不能充分的填充而產生應力屏蔽，由于應力屏蔽的存在致使在移植材料和骨組織之間產生機械特性不匹配，從而導致較低的界面粘合強度和松弛的界面?？朔@種缺點的方法是應用多孔金屬材料，許多研究者致力于研究多孔金屬作為移植材料，它提供了一個可以調整的機械特性和為骨組織向內生長的三維互聯的孔隙結構。已有研究發現，多孔支架的三維結構包括孔徑、孔形態、孔間連接方式等對于細胞的遷移、分布、生長以及新生組織的形成等均具有重要作用。這樣，極大的改善了支架表面相容性和機械特性相容性。雖然傳統的方法包括相分離、發泡法、粒子瀝濾等可以制造出各種孔隙的多孔支架，但是，這些方法缺乏對孔結構(如孔的尺寸、空間走向、連通性等)的控制，更缺乏制造復雜外形的能力[5～7]。常常不能滿足上述骨移植物的條件。近年來，快速成形技術的廣泛應用，不但可以實現植入體復雜外形的加工制造，而且還能夠精確控制植入體的內部孔隙結構，包括孔的尺寸、形狀、空間走向、連通性等。但是，許多研究者把應用快速成形技術的注意力主要集中在研究聚合物和陶瓷材料上[7～9]，而對于能夠精確控制孔結構的鈦支架卻很少有報道，最近，Garrett E等[10]、Li等[11]應用快速成形技術成功的制造出了三維多孔的鈦支架，然而上述過程并不是金屬直接形成過程，應用快速成形技術對多孔金屬支架的直接構建技術是一種非常有前景的技術。

本實驗研究通過應用電子束融化快速成形技術成功的實施了對多孔鈦合金支架的直接構建。支架類似于正常人松質骨的彈性模量(2.7 GPa)，避免了支架和骨組織之間的應力屏蔽;良好的抗壓強度(110 MPa)為承重部位的骨缺損的修復和重建提供了一個良好的力學性能支撐;其65%的均質多孔性能和約為1.05 mm的孔徑，符合組織工程支架的設計，孔徑的誤差考慮到將來支架的收縮和在表面涂層，故所設計的支架孔徑大小比骨組織向支架內長入的理想孔徑大小要大。另外，支架可以精確控制的宏觀結構(類蜂巢狀結構)和微觀結構(如孔尺寸、形狀、空間走向、連通性等)獲得了傳統制備方法不可比擬的優勢，為細胞、毛細血管、骨組織的長入以及體內營養的均勻供給提供了一個良好的載體。

本實驗應用MTT法、掃描電鏡、組織切片染色、ALP活性定量檢測等方法探討了上述優化技術設計出的鈦合金支架作為成骨細胞體外培養載體的可行性，以及觀察由這種設計方法設計出的類蜂巢狀孔結構支架在培養中的作用。MTT法測定以及ALP活性定量檢測結果顯示，實驗組細胞數量和活性隨著培養時間的延長而明顯增加，與對照組比較差異顯著(P<0.05)，這充分表明支架對成骨細胞沒有抑制作用，反而細胞數量及活性明顯增加?？紤]其原因為:(1)支架與細胞具有良好的相容性，支架具有一定的促進細胞黏附、增殖和分化的特性; (2)細胞在三維類蜂巢狀多孔材料中較平面培養以及其他形狀的支架對營養的接觸吸收及代謝產物的排出更為有利。其具體機理還有待于進一步研究。掃描電鏡觀察結果證實：隨著培養時間的延長，細胞由單層結構變為多層結構并且細胞由支架表面逐漸向支架內部延伸并貫穿孔與孔之間，表明細胞已均勻分布于整個支架內部，證明了支架與成骨細胞良好的組織相容性，同時觀察顯示，支架表面及內部淺層、中心管道內細胞形態、密度基本一致，證明相互連通的管道結構以及類蜂巢狀孔隙結構是引導均勻有序的營養供應和細胞分布的結構基礎，為成骨細胞的粘附、增殖、分化以及移動提供了非常有利的條件。組織切片染色進一步的證實，隨著培養時間的延長，細胞能夠在支架上很好的粘附、增殖、分化，并逐漸向支架孔隙內伸展，這說明支架能夠很好的作為細胞的載體而促進細胞的增長，并且細胞在支架表面、內部孔壁甚至孔隙內部均有生長，說明類蜂巢狀孔隙結構在其中扮演了重要的角色，它為細胞生長、孔與孔之間的相互細胞連接以及進一步的組織相互連接提供了一個良好的載體微孔結構。

綜上所述，本實驗利用電子束融化快速成形技術成功的制備了多孔鈦合金支架。同時，通過對支架生物活性檢測進一步證實了支架具有良好的生物相容性，不僅能夠作為成骨細胞體外共培養的載體，而且還將進一步成為血管以及骨組織的長入的良好載體。其類蜂巢狀多孔結構在支架內實現均勻的營養供給，促進了細胞增殖、分化及在支架內的均勻分布。因此多孔鈦合金支架良好的物理學行為和生物學特性為臨床修復承重部位骨缺損提供了一種很有前景的選擇方法并為今后組織工程支架的制備及相關應用研究提供了可能。