作者：唐良華，趙長虹，王愛民

【摘要】 目的 檢測載萬古霉素（VCM）聚DL乳酸（PDLLA）的抗感染骨折內(nèi)固定鈦合金鋼板的生物安全性。方法 以PDLLA為載體，采用溶劑澆鑄（solvent casting）技術(shù)，在鈦合金板基體表面制備了攜載VCM的PDLLA涂層，通過全身急性毒性試驗、熱原試驗、溶血試驗、局部刺激試驗、骨髓微核試驗等來檢測其生物安全性。結(jié)果 鋼板表面獲得的載VCMPDLLA涂層經(jīng)試驗證實對動物無明顯毒性反應(yīng)。結(jié)論 載VCMPDLLA鈦鋼板具有良好的生物安全性。

【關(guān)鍵詞】 萬古霉素；聚DL乳酸；鈦合金；涂層

Abstract： Objective To evaluate the biological safety of an internal fixation plate which can inhibit infection by carrying and slowreleasing Vancomycin.Methods PDLLA coating with Vancomycin was prepared on the surface of titanium plate by solvent casting technology with the PDLLA as a carrier；the biological safety of VancomycinPDLLA loaded plates was tested by acute systemic toxicity test，hemolytic test，pyrogen test，et al.Results There was no toxicity for the VancomycinPDLLA loaded antibacterial titanium alloy plates.Conclusion There is a good biocompatibility for the VancomycinPDLLA loaded antibacterial titanium alloy plates.

Key words:vancomycin；PDLLA；titanium alloy；coating

臨床上骨科內(nèi)固定手術(shù)后，由于感染導(dǎo)致內(nèi)固定失敗，或者因為感染后形成的具有高抗藥性的生物膜，即使全身應(yīng)用大劑量抗生素，在病灶局部組織中亦難以達到有效的抗生素濃度，導(dǎo)致感染久治難愈，最終不得不取出內(nèi)固定，若能在內(nèi)固定物的表面搭載抗生素，從而直接在病灶局部直接釋放出高抗菌濃度的抗生素，獲得較全身大劑量使用抗生素更有效的濃度，以最大限度地殺滅局部病菌，同時減少病菌耐藥性的出現(xiàn)，解決常規(guī)用藥方式效率不高且毒性較大這一問題。近30年來在一系列新的生物相容性較好的無機材料和有機高分子材料基礎(chǔ)上逐漸發(fā)展起來的新型局部給藥方式——抗生素緩釋系統(tǒng)，在治療骨髓炎、骨結(jié)核和感染性骨缺損等方面有著廣闊的應(yīng)用前景［1-4］。聚DL乳酸(PDLLA)材料是一類在生物體內(nèi)能發(fā)生降解，其降解產(chǎn)物是乳酸，該物質(zhì)是人體新陳代謝過程中一種代謝產(chǎn)物。由于PDLLA具有良好的生物相容性和可降解吸收性［5，6］，若能將其與內(nèi)固定材料及抗生素結(jié)合起來，制作出抗生素緩釋系統(tǒng)，則使局部用藥治療感染的效果能夠得到大大提高。本文以具有良好生物相容性和可降解性的PDLLA為載體，采用溶劑澆鑄的方法，在鈦合金植入物表面制備了攜載萬古霉素（VCM）的PDLLA的抗感染涂層。但應(yīng)用于臨床必須要具有良好的生物相容性，無明顯毒性反應(yīng)，本部分通過動物體內(nèi)及體外試驗對載VCMPDLLA鈦鋼板的生物安全性進行初步評價。

材料與方法

1 材料及制備

1 材料、試劑與動物 醫(yī)用鈦合金鋼板（第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院提供），切割為15 mm×10mm×5mm的立方體；鹽酸萬古霉素（商品名為穩(wěn)可信，Eli Lilly Japan K.K，Seishin Laboratories生產(chǎn)）；聚乳酸（DL型，分子量MW=58000Da，中國四川迪康醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)）；所有試驗試劑（如乙酸乙酯、丙酮、乙醇等）均為分析純。

健康昆明純系小白鼠，新西蘭大白兔均由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所試驗動物中心提供。

1.2 載VCM鋼板涂層的制備 采用solvent casting技術(shù)［7］，將鈦板用400、600#金相砂紙打磨后依次用丙酮、70%乙醇和蒸餾水超聲清洗各10分鐘，晾干后浸入98%H2SO4+30%H2O2(體積比7：3)的混合溶液中1小時，取出，蒸餾水充分清洗后，40℃烘干，消毒備用。精確稱取PDLLA 2.0g，充分溶解于40ml乙酸乙酯中，然后加入VCM 0.1g，超聲振蕩，形成5%的分散均勻的混合溶液。將上述處理后的鋼板浸沒于配制的混合溶液中5分鐘，取出，靜置10分鐘晾干后再次浸入，重復(fù)3次。然后取出，室溫下過夜干燥，溶劑揮發(fā)后即得到載VCMPDLLA鈦合金鋼板。環(huán)氧乙烷消毒備用。

1.3 浸提液的制備 載VCMPDLLA鈦合金鋼板經(jīng)環(huán)氧乙烷消毒后，無菌條件下，將其放入無菌三角瓶內(nèi)，在37℃水浴箱中用生理鹽水持續(xù)浸泡72小時 （材料重量與浸提遞質(zhì)容量的比例為1g：5ml），制備材料浸提液。

2 試驗方法

2.1 全身急性毒性試驗 選用健康小白鼠10只，雌雄各半，體重17～23g。將小鼠隨機分試驗組和對照組2組，每組5只。試驗組小鼠腹腔注射材料浸提液，每只小鼠注射劑量為50ml/kg；對照組腹腔注射無菌生理鹽水50ml/kg，于注射后即刻及24、48、72小時觀察和記錄實驗組和對照組小鼠一般狀態(tài)、毒性表現(xiàn)和死亡動物數(shù)（觀察指標(biāo)見表1［8］）。于注射前及注射后24、48、72小時稱重并記錄兩組小鼠的體重變化。表1 注射后小鼠反應(yīng)觀察指標(biāo)

程度癥狀無毒未見毒性癥狀輕度毒性有呼吸困難或腹部刺激輕度癥狀，但無運動減少 中度毒性呼吸困難，腹部刺激癥狀，運動減少，眼瞼下垂，腹瀉，體重降至15～17g重度毒性衰竭，發(fā)紺，震顫，嚴(yán)重腹部刺激癥狀，呼吸困難，眼瞼下垂，體重降至15g以下 死亡注射后死亡

2.2 熱原試驗 選用新西蘭大白兔5只，雌雄不限，體重2.2～2.5kg。試驗前1周挑選健康新西蘭大白兔5只，雌雄不限，體重2.2～2.5kg，體溫均在38.0～39.6℃之間，隨機編為1～5號，測體溫時用精確肛溫計插入家兔肛門約6cm左右，測溫時間1.5分鐘；測溫前1周用同種飼料喂養(yǎng)，精神、食欲、排泄等無異常，體重?zé)o減輕。7天后在同樣室溫和溫度下正式試驗，每隔30分鐘測量體溫1次，共測3次。取其平均值作為正常體溫。然后分別自耳緣靜脈靜推溫度為38℃的材料浸提液（10ml/kg）。注射后每隔1小時測量體溫1次，共3次，3次體溫中最高的1次減去正常體溫即為試驗兔體溫升高值。若升高值<1.4℃說明沒有致熱源物質(zhì)存在。

2.3 溶血試驗 抽取健康新西蘭大白兔靜脈血10ml，加入2%草酸鉀0.5ml，取此兔血8ml加入生理鹽水10ml進行稀釋即制備出新鮮稀釋兔血。將試驗組（樣品浸提液）、陰性對照組（生理鹽水）、陽性對照組（雙蒸水）試液10ml分別置于50ml三角瓶中，每組各設(shè)3個三角瓶，置于37℃水浴中30分鐘。然后在各瓶中加入新鮮稀釋兔血0.2ml輕輕搖勻，在37℃水浴中繼續(xù)保存60分鐘，以2000r/min×5分鐘將所有試管離心，取上清，用BioSpecmini紫外分光光度計（SHIMADZU日本）于波長545nm測吸光度，試驗組和對照組吸光度均取3瓶平均值。溶血程度用溶血率(%)表示，按下式計算，溶血率(％)=［(試驗樣品的吸光度值一陰性對照的吸光度值)/(陽性對照的吸光度值一陰性對照的吸光度值)］×100％。若試驗組溶血率>5%為陽性反應(yīng)，表示有溶血現(xiàn)象。

2.4 局部刺激試驗

2.4.1 皮內(nèi)注射刺激試驗 3只新西蘭大白兔脫毛備皮，分別在每只兔左后大腿外側(cè)皮內(nèi)注射0.1ml材料浸提液，右后大腿外側(cè)注射等量生理鹽水。分別于注射后1、24、48、72小時觀察并記錄注射部位皮膚及周圍組織有無局部紅腫等刺激反應(yīng)。

2.4.2 原發(fā)性皮膚刺激試驗 3只新西蘭大白兔脫毛備皮，并在每只兔雙側(cè)后腿及左前腿外側(cè)各劃#形損傷傷口(面積約3cm×3cm)，在所有兔左前腿外側(cè)創(chuàng)面各自涂敷0.1ml浸提液，兔左后腿外側(cè)傷口涂敷甲醛0.1ml為陽性對照，兔右后腿外側(cè)傷口涂敷0.1ml生理鹽水為陰性對照，用消毒紗布覆蓋，24小時后移去斑貼物，觀察1、24、48、72小時并記錄受試物對兔破損皮膚有無刺激作用。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS軟件13.0進行分析。正態(tài)分布計數(shù)資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用配對資料t檢驗，P<0.05為差異顯著。

結(jié) 果

1 全身急性毒性試驗

在72小時觀察期內(nèi)，對照組和試驗組小鼠一般情況良好，活動、食欲正常，呼吸平穩(wěn)，無驚厥、腹瀉、癱瘓和死亡等毒性反應(yīng)，體重漸增（見表2），符合GB/T16886．111997的規(guī)定。

2 熱原試驗

5只新西蘭大白兔體溫升高值<1.4℃（見表3），說明該樣品符合熱原檢查的規(guī)定。

3 溶血試驗

按照每組測定值的平均吸光度值計算得溶血率為2.41%（見表4），溶血率<5%，即說明該材料無明顯的溶血反應(yīng)存在。符合規(guī)定≤5%的標(biāo)準(zhǔn)。

4 局部刺激試驗

皮內(nèi)注射刺激試驗觀察1～72小時，試驗側(cè)注射點與對照側(cè)注射點均無明顯刺激反應(yīng)；原發(fā)性皮膚刺激試驗觀察1～72小時，試驗側(cè)與陰性對照側(cè)注射點均無明顯刺激反應(yīng)，但陽性對照側(cè)皮膚于1～24小時逐漸出現(xiàn)輕微紅斑、水腫，于48小時出現(xiàn)明顯紅斑及水腫，于72小時出現(xiàn)焦痂。證明該材料局部刺激試驗合格，符合生物材料的要求。表2 對照組和實驗組小鼠體重變化記錄表4 溶血試驗結(jié)果

討 論

載抗生素內(nèi)植入物是指在不改變普通內(nèi)植入物原有物理性能、化學(xué)特征的基礎(chǔ)上，將抗生素與生物材料如PDLLA或聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）聚合后噴涂在內(nèi)植入物表面使用，或?qū)⒖股嘏c內(nèi)植入物如骨水泥聚合后使用，從而使普通內(nèi)植入物具有了抗菌性能，此種抗菌性能可以采用緩釋系統(tǒng)逐漸將抗生素釋放出來，當(dāng)有細(xì)菌侵入或者發(fā)生感染時，釋放出來的抗生素就會殺滅細(xì)菌，從而起到抗菌的作用。生物相容性是生物醫(yī)用材料與人體之間相互作用產(chǎn)生各種復(fù)雜的生物、物理、化學(xué)反應(yīng)的一種概念。當(dāng)載抗生素內(nèi)植入物表面與組織、血液、細(xì)胞等短期或長期接觸時，材料與機體之間的相互作用使各自的功能和性質(zhì)受到影響。因此在生物醫(yī)學(xué)方面要求載抗生素內(nèi)植入物應(yīng)該對人體無毒性、無熱原反應(yīng)、無溶血反應(yīng)和無刺激性等，對人體組織、血液等不產(chǎn)生不良作用。

本試驗選用的VCM屬于糖肽類抗生素，直接作用于細(xì)菌細(xì)胞壁前體羧基末端的D丙酰胺D丙氨酸（DAlaDAla），抑制細(xì)胞壁蛋白的合成，對革蘭氏陽性菌有強效的殺滅作用，是治療耐甲氧西林表皮葡萄球菌和耐甲氧西林金葡菌感染的特效藥物。由于其全身引用會造成較嚴(yán)重的肝、腎等重要臟器的損害，因此被認(rèn)為是較理想的的局部應(yīng)用的抗生素之一；而PDLLA具有良好的生物相容性、可降解吸收性、良好的力學(xué)穩(wěn)定性和良好的的成骨誘導(dǎo)性，它在植入物表面通過水解作用從而降解需要3～6個月時間，最終降解產(chǎn)物是CO2和H2O，中間代謝產(chǎn)物乳酸也是體內(nèi)正常糖代謝產(chǎn)物，其降解產(chǎn)物最終通過檸檬酸循環(huán)而代謝，因此在體內(nèi)不會對人體產(chǎn)生明顯的不良影響［5，6，9］。而鈦合金鋼板具有良好的與人體骨骼接近的彈性模量，鈦無毒、質(zhì)輕、強度高且具有優(yōu)良的生物相容性，是非常理想的醫(yī)用金屬材料，可用作植入人體的植入物等。由于以上的這些優(yōu)點，將PDLLA和VCM結(jié)合起來，以solvent casting技術(shù)制作成涂層貼附在鈦合金鋼板上，通過PDLLA的逐漸降解和VCM的逐漸釋放，起到在局部達到有效的抗菌濃度，從而直接殺滅病原菌的作用。

對于體內(nèi)長期植入的材料， 根據(jù)國際標(biāo)準(zhǔn)化組織（ISO）的規(guī)定， 須進行生物相容性評價。VCM和PDLLA雖然具有良好的生物相容性，但是當(dāng)兩者以乙酸乙酯為溶劑，在鋼板表面形成的抗感染生物涂層是否具有毒性，還需要實驗驗證。故本試驗參考醫(yī)療器械生物學(xué)評價標(biāo)準(zhǔn)進行評估［10-13］。急性毒性試驗是一種特異急性毒性試驗，本試驗的結(jié)果顯示載VCMPDLLA鈦鋼板材料浸提液對試驗動物未產(chǎn)生任何毒性反應(yīng)， 更未影響到動物的生存；熱原試驗?zāi)軌蛉娴臋z出內(nèi)毒素所致或非內(nèi)毒素所致的熱原物質(zhì)，熱原物質(zhì)進入人體超過一定限量后，會發(fā)生熱原反應(yīng)，引起患者發(fā)熱，嚴(yán)重的會造成死亡，本試驗結(jié)果顯示每只新西蘭大白兔體溫升高值均<0.4 ℃，符合熱源試驗體溫升高值<1.4℃的要求；溶血試驗是細(xì)胞毒性評價的一個補充性的、而且比較靈敏的試驗，溶血試驗的結(jié)果顯示溶血率為2.41%， 符合醫(yī)用材料的溶血率≤5%的要求；局部刺激試驗的結(jié)果說明載VCMPDLLA鈦鋼板無皮膚刺激作用。

通過以上系列試驗說明載VCMPDLLA鈦合金鋼板具有良好的生物安全性，是一種無毒、無刺激性、不含熱原物質(zhì)，有良好血液相容性的骨內(nèi)固定材料，可做為一種安全的骨植入材料進行動物及臨床試驗。同時其細(xì)胞毒性等其他一些生物相容性評估還需要進一步研究。