【摘要】 目的］通過體內實驗的方法對新型β型鈦合金（TiNbZr）骨折內固定材料的生物相容性進行評價。［方法］（1）改良的鼠氣囊模型（the air pouch model）：健康成年SD大鼠24只，皮下充氣造模后將鈦鈮銑β型鈦合金（TiNbZr）顆粒混懸液注入氣囊，收集囊內液體采用ELISA方法測定IL6和TNFα，用囊壁組織學切片進行炎癥細胞反應分級和囊壁厚度測量，并與傳統的鈦鉛釩合金（Ti6Al4V）進行比較。（2）接骨板植入模型：將TiNbZr做成接骨板固定在兔的脛骨上，于手術后4、8、12、24、36周分別觀察接骨板周圍的纖維膜形成情況和TiNbZr骨界面骨結合情況，并與不銹鋼接骨板比較。［結果］（1）Ti6Al4V、TiNbZr兩種顆粒注入氣囊48 h后都能引起TNFα分泌量顯著升高（P<005），兩組比較，Ti6Al4V組明顯高于TiNbZr組（P<005）。兩種材料均不能引起IL6分泌的顯著增加（P>005）。TiNbZr組氣囊囊壁厚度明顯小于Ti6Al4V組（P<0001）。（2）TiNbZr接骨板周圍軟組織反應與不銹鋼相近。植入后4周，新生骨痂開始覆蓋TiNbZr接骨板的兩側，8周時骨痂甚至部分覆蓋接骨板和螺釘的表面形成“骨蓋板”現象。12周時，骨與TiNbZr接骨板的界面為直接接觸，中間無軟組織間隔。螺釘與骨也能形成較為牢固的釘骨直接接觸。［結論］低彈性模量TiNbZr β鈦合金具有優良的體內組織相容性，是一種有前途的骨折內固定材料。

【關鍵詞】 內固定鈦鈮鋯生物相容性材料體內研究

Abstract［Objective］To develop new beta titanium alloys made of titanium， niobium and zirconium (TiNbZr) which have higher strength， lower moduli of elasticity Its biocompatibility in vivo is evaluated in this paper ［Method］(1) 24 SD rats were used in the modified air pouch model experiments Air was injected subcutaneously on the back of rats to form the pouches and the TiNbZr particles were introduced into them The liquid in the pouches was harvested 48 hours later for IL6 and TNFαELISA procedure and the capsules for histology examination All the results were compared with Ti6Al4V (2) TiNbZr bone plates were fixed onto tibias of rabbits The capsules around the plates and the bone under them were observed at 4， 8， 12， 24 and 36 weeks respectively TiNbZrbone interfaces were emphasized in this procedure This time the control material was stainless steel ［Result］(1)TiNbZr and Ti6Al4V particles made the air pouches secret more TNFα than that of the control (P<005) Ti6Al4V particles made the effect more prominent than TiNbZr particles did (P<005) This effect was not seen in IL6 menstruations experiments The thickness of the air pouches was different in two groups It was thinner in the TiNbZr group than that in Ti6Al4V group (P<0001)(2)After 4 weeks of TiNbZr bone plates' implantation the new callus formed beside the plates The “callus overlay the plate” phenomenon was seen after 8 weeks In 12 weeks a kind of direct integration had formed in the boneplates interfaces No soft tissue was seen in them The same direct integration was also seen in the bonescrew interfaces ［Conclusion］The TiNbZr beta titanium alloys developed in this study have lower modulus and high biocompatibility both Its perfect biocompatibility in vivo shows that it is a promising material for internal fixation instruments

Key words：internal fixaion;titaniumniobiumzirconium;biocompatible materials;in vivo

作者自行研制了低彈性模量鈦鈮鋯β型（TiNbZr）合金〔1〕，在體外生物相容性實驗取得良好結果的基礎上，進一步對其體內生物相容性進行進一步的評價。考慮到TiNbZr作為骨折內固定材料的具體應用前景，實驗將賈慶衛等 〔3〕的大鼠氣囊模型（the air pouch model）應用于TiNbZr材料的生物相容性的評價，并將TiNbZr制成接骨板植入動物體內，觀察骨和軟組織對該材料的反應，為其臨床應用提供更有價值的實驗資料。

1材料與方法

11金屬材料顆粒的制造與顆粒混懸液的制備

方法參見賈慶衛等〔2〕，人工關節金屬磨損顆粒體外制備分離方法的實驗研究。

12大鼠氣囊模型 (the air pouch model) 的建立

方法參見賈慶衛等〔3〕，改良大鼠氣囊模型在人工關節假體松動研究中的應用。

13大鼠氣囊模型對各種金屬顆粒的生物學反應觀察

健康成年SD大鼠24只，隨機分為4組，每組6只。分籠飼養2周無疾病表現者進入實驗。氯胺酮腹腔麻醉，背部75%酒精消毒，皮下注入空氣20 ml， 形成皮丘。48 h后氣囊穿刺，再次注入空氣10 ml。24 h后分別注入Ti6Al4V、TiNbZr顆粒混懸液5 ml（顆粒濃度25×107/ml），48 h后穿刺抽液，收集囊內液體，75 ℃凍存備用。

囊內液體采用ELISA方法測定IL6和TNFα。測定用ELISA試劑盒購自BioSource USA。操作方法同前。

14大鼠氣囊模型對各種金屬顆粒的組織學反應觀察

48 h后大鼠頸椎脫臼法處死，背部正中切口，將氣囊完整摘除，4%甲醛固定1周，脫水、透明、石蠟包埋，連續切片，厚度5 μm，常規HE染色，光鏡觀察。重點觀察反應膜中的細胞構成，并按國家標準GB/T 161751996中植入實驗炎癥細胞反應分級標準進行分級（表1）。

表1GB/T161751996材料植入實驗炎癥細胞反應分級標準級別炎癥細胞反應Ⅰ級試樣周圍未見或僅見極少量的淋巴細胞Ⅱ級試樣周圍可見少量淋巴細胞Ⅲ級試樣周圍有少量嗜中性粒細胞，淋巴細胞和巨細胞反應Ⅳ級試樣周圍可見以嗜中性粒細胞浸潤為主的炎癥反應，可見吞噬細胞

在放大100倍光鏡下與顯微標尺（10 μm）共同拍照，獲得圖像輸入計算機，利用UTHSCSA ImageTool 300圖像處理軟件測量囊壁厚度。先利用標尺校準測量長度為10 μm，在囊壁處隨機選取6個測量點，則可以讀出每個測量點的厚度數值(圖1)。

15TiNbZr接骨板的體內植入實驗

采用317不銹鋼和TiNbZr材料分別加工4孔接骨板（接骨板長40 mm，寬7 mm，厚2 mm，螺孔間距22 mm。螺絲釘外徑2 mm，內徑18 mm，長12 mm，螺帽直徑4 mm）。選健康新西蘭兔20只，體重25~30 kg。隨機分為5組，每組4只。25%戊巴比妥鈉耳緣靜脈麻醉后，手術顯露雙側脛骨中段，左側以TiNbZr接骨板內固定（圖2a），右側以317不銹鋼接骨板內固定作為對照（圖2b）。術后動物分籠飼養，術后應用青霉素3 d，允許自由活動。

分別與手術后4、8、12、24、36周處死，切取接骨板表面軟組織4%甲醛固定1周，脫水、透明、石蠟包埋，連續切片，厚度5 μm，常規HE染色，光鏡觀察。

重點觀察反應膜中的細胞構成，并按國家標準GB/T 161751996中植入實驗纖維囊腔形成分級標準進行分級。分級標準見表2。

表2GB/T161751996中材料植入實驗纖維囊腔形成分級標準級別纖維囊形成Ⅰ級囊腔厚度穩定，無繼續增生現象Ⅱ級纖維化囊腔致密，囊腔厚度較形成初期為薄Ⅲ級試樣周圍可以見到成纖維細胞、纖維細胞與膠原纖維并已形成囊腔結構Ⅳ級試樣周圍可見小血管、纖維細胞增生并開始形成疏松的囊壁

拆除接骨板后截取內側釘孔之間的骨段，4%甲醛固定1周，75%、85%、95%、100%乙醇梯度脫水，透明MMA包埋，硬化后行50 μm切片，常規磨片、拋光、超聲清洗。Van Gieson染色：01%甲酸2 min，流水洗滌2 min，20%甲醇2 h，流水洗滌2 min，60 ℃下Stevenol藍染色15 min，60 ℃蒸餾水2 min，Van Gieson苦味酸品紅染色8 min，100%乙醇脫水，中性樹脂封片。

光學顯微鏡下觀察，顯微攝影數碼相機攝取圖像。

15統計學分析

實驗測量結果經SAS 612軟件處理。組內各參數之間的比較用方差分析，兩組比較用q檢驗，以P<005表示差異有顯著意義，P<001為差異有非常顯著性意義。

2結果與分析

21大鼠氣囊模型對金屬磨損顆粒的生物學反應觀察

Ti6Al4V、TiNbZr兩種顆粒注入氣囊48 h后都能引起TNFα分泌量顯著升高（P<005），兩組比較，Ti-6AI-4V組明顯高于鈷鉻鉬組和TiNbZr組（P<005）。

2種材料組的IL6分泌量對照組（鈷鉻鉬）比較，但各組間無顯著差異（P>005）(表3)。

表3鈷鉻鉬、Ti-6AI-4V、TiNbZr氣囊 TNFα

和IL6分泌量的比較（pg/ml）分組對照（鈷鉻鉬）組Ti-6AI-4V組TiNbZr組TNFα1287±6642*16406±5623**8739±8236IL618898±3326△27297±461930035±4947*TNFα，對照組與每個實驗組比較P<005;**TNFα，Ti6Al4V和TiNbZr組比較P<005;△IL6，對照組與每個實驗組比較P>00522大鼠氣囊模型對各種金屬顆粒的組織學反應觀察

Ti6Al4V組囊壁明顯增厚，可見少量的中性粒細胞和嗜堿性粒細胞，炎癥細胞反應為III級（圖3）。

TiNbZr氣囊較薄，炎癥細胞反應為III級（圖4）。

氣囊囊壁厚度：Ti6Al4V組> TiNbZr組>空白對照組。兩兩比較，每兩組間均有明顯差異P<0001(表4)。

表4各種金屬材料氣囊囊壁厚度測量數值 （μm）組別分組N囊壁厚度（x±s）1空白對照361650750±1878582鈦鋁釩368308600±8374553TiNbZr364758420±785791

23TiNbZr接骨板的體內植入實驗

一般情況：2只動物右側切口（317不銹鋼接骨板側）發生術后切口感染，1只經切開引流愈合，另1例形成接骨板旁膿腫，至取材時才發現。感染動物實驗數據未納入統計。所有動物均無接骨板外露。圖1光鏡下囊壁厚度測量圖片與10微米顯微標尺（100×）

圖2TiNbZr接骨板的體內植入實驗圖3Ti6Al4V囊壁組織光鏡下形態，囊壁鏡下為緊貼肌肉內層的纖維結締組織膜，主要由纖維組織和成纖維細胞構成，囊壁內可見少量的淋巴細胞，炎癥細胞反應為II級（HE染色，100×）圖 4TiNbZr組囊壁光鏡下形態，囊壁較薄，可見少量的中性粒細胞和嗜堿性粒細胞，炎癥細胞反應為III級（HE染色，100×） 圖58周后骨痂開始覆蓋TiNbZr接骨板的表面和螺釘，形成“骨蓋板”的現象圖6317不銹鋼接骨板的兩側也可以見到骨痂的增生，但未覆蓋接骨板的表面圖7TiNbZr接骨板周圍被新生的大量成熟的骨痂包繞，界面↑為骨與接骨板的直接致密結合，中間無纖維及膠原軟組織間隔（Van Gieson染色，100×）圖8317不銹鋼骨板界面有纖維及膠原軟組織間隔，可以見到軟組織間隔剝脫。骨表面形成小的囊樣變↑，內部被膠原組織填充（Van Gieson染色，100×）圖9 317不銹鋼和TiNbZr接骨板植入12周的螺釘釘道組織切片顯示：317不銹鋼和TiNbZr螺釘與骨都能形成較為牢固的釘骨直接結合，釘骨界面無軟組織間隔（Van Gieson染色，40×）大體觀察：從接骨板植入4周，新生骨痂開始覆蓋TiNbZr接骨板的兩側，8周時骨痂甚至部分覆蓋接骨板的表面和螺釘（圖5）。12周后這種“骨蓋板”的現象逐漸減少，至36周就極少見到。317不銹鋼接骨板的兩側也可以見到骨痂的形成，但未見到覆蓋接骨板的表面和螺釘的現象（圖6）

接骨板骨界面觀察： 接骨板植入12周，317不銹鋼和TiNbZr接骨板與骨組織形成骨板界面。TiNbZr接骨板周圍被新生的大量成熟的骨痂包繞，與大體觀察中的“骨蓋板”現象相吻合，界面為骨與接骨板的直接接觸，中間無軟組織間隔（圖7）。

317不銹鋼骨板界面可見部分致密結合，大部分骨的表面有纖維及膠原軟組織間隔，由于取出接骨板時的破壞，形成可見的軟組織間隔剝脫。骨表面形成小的囊樣變，內部被膠原組織填充（圖8）。

317不銹鋼和TiNbZr接骨板植入12周的螺釘釘道組織切片顯示：317不銹鋼和TiNbZr螺釘與骨都能形成較為牢固的釘骨直接結合，釘骨界面無軟組織間隔（圖9）。

3討論

生物相容性是任何新型生物材料進入臨床應用以前必需認真考慮的問題。生物相容性評價是一個非常廣義的概念。傳統實驗多采用皮內刺激實驗、黏膜刺激實驗、急性全身毒性實驗、溶血實驗、熱源實驗等方法。對于骨科內植物材料相容性的評價從開始就應該包括生物相容性和力學相容性兩個方面。實驗方法也應更加重視采用體內實驗模型。

在前期的體外實驗中作者得到結論：低彈性模量TiNbZr β鈦合金具有優良的體外組織相容性，是一種有前途的人工關節假體材料。（1）工作中采用L929細胞（小鼠成纖維細胞）對合金進行細胞毒性試驗，TiNbZr的細胞毒性為0級。（2）將1 μm左右的TiNbZr顆粒與J774A1巨噬細胞體外共同培養24~48 h后，吞噬了TiNbZr顆粒的J774A1巨噬細胞形態改變明顯輕于鈷鉻鉬顆粒組和鈦鋁釩顆粒組。巨噬細胞與鈦鋁釩合金顆粒、鈷鉻鉬合金顆粒和TiNbZr顆粒共同培養48 h后都有IL6和TNFα mRNA表達的增加，鈷鉻鉬顆粒和鈦鋁釩顆粒引起巨筮細胞增加更加明顯。巨噬細胞吞噬TiNbZr顆粒48 h后分泌TNFα的量明顯低于鈦鋁釩和鈷鉻鉬（P<005）。

在金屬磨損顆粒與巨噬細胞共同培養的實驗中通常能發現鈦合金的釩能刺激巨噬細胞產生更多的骨吸收因子，這些細胞因子在人工關節松動中起重要作用，所以β鈦合金的發展趨勢是選用生物相容性更好的元素。這是β鈦合金生物相容性優良的物質基礎。Seligson〔4〕采用經過表面硬化處理的Ti13Nb13Zr接骨板治療羊脛骨骨折，固定16周后研究發現與Ti6Al4V相比β鈦合金固定更加牢固，術后感染機會減少。

早期的β鈦合金用鉬取代了有細胞毒性的釩和鋁。Khan證實Ti15Mo(TM)在模擬體液環境下有良好的耐腐蝕性能。在705例病人中作的金屬敏感性實驗說明含鉬的β鈦合金不會引發變態反應。現代的β鈦合金則傾向于選取生物相容性更好的鈮、鋯、鉈、鈽等元素，如Long 〔5〕證實了Ti13Nb13Zr的生物相容性優良。Ti50Zr合金在Ringer’s和PBS液體中容易形成表面氧化膜，因而具有生物不敏感性〔5〕。日本學者研制的Ti29Nb13Ta46Zr在體外實驗中表現出良好的生物相容性〔7、8〕。有研究表明，通過生物相容性元素Nb 、Ta、 Zr的嚴格組合可使潛在的組織反應達到最小。

骨科植入物材料力學相容性是必須考慮的生物相容性問題。目前臨床常用的不銹鋼、Co合金的彈性模量遠遠高于人體骨組織，這些材料與骨之間彈性模量的不匹配，使載荷不能由植入物很好地傳遞到相鄰骨組織，出現“應力遮擋”現象，從而導致假體周圍骨吸收和關節假體松動。我們在國內首次研制的TiNbZr合金的彈性模量為65 Gpa左右（最小52 GPa，最高僅為735 Gpa），已經達到某些碳纖維復合材料的水平〔10〕，與人體皮質骨的彈性模量更加接近。因此這些合金有望進一步減弱“應力遮擋” 效應。本研究中制備合金的強度大多在650~850 MPa之間；其延伸率也較高，最高可達23%。另外，所制備合金在鑄造、熱成型和機械加工方面已經顯示出良好的性能。