作者：王洪江 柳婷 謝躋 粟婉媛 郭愛(ài)玲 蔡朝霞

【摘要】 以CdCl2和Na2S為原料，以巰基乙酸為穩(wěn)定劑，采取水相合成方法制備了CdS量子點(diǎn)。結(jié)果表明，合成CdS量子點(diǎn)最佳條件是：作用時(shí)間3 h，[Cd2+]∶[S2-]為2∶1， 50 μL穩(wěn)定劑，pH 8.0，反應(yīng)溫度30 ℃。通過(guò)EDC·HCl和NHS的作用，成功地將單增李斯特菌抗體IgG與CdS量子點(diǎn)偶聯(lián)。偶聯(lián)后的IgGCdS熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，為偶聯(lián)前的4倍。血清凝集反應(yīng)和直接免疫熒光實(shí)驗(yàn)證明，偶聯(lián)CdS量子點(diǎn)的單增李斯特菌抗體的特性沒(méi)有發(fā)生變化，在熒光顯微鏡下可快速靈敏地檢測(cè)出單增李斯特菌。本方法特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性和重復(fù)性高，可用于食品中致病菌的快速檢測(cè)。

【關(guān)鍵詞】 量子點(diǎn);單增李斯特菌;偶聯(lián);熒光強(qiáng)度

1 引 言

CdS為ⅡⅥ型量子點(diǎn)，是常見(jiàn)核殼型量子點(diǎn)的主要組成部分[1]。CdS量子點(diǎn)具有良好的光學(xué)性質(zhì)，合成發(fā)射不同顏色熒光的水溶性CdS量子點(diǎn)對(duì)于多色生物標(biāo)記和核殼型量子點(diǎn)合成具有重要意義。有關(guān)CdS量子點(diǎn)的制備的研究較多[2～5]，且多采用化學(xué)液相法。該方法具有反應(yīng)條件溫和、易控制，可制得組成均勻、純度高的納米材料等優(yōu)點(diǎn)。

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes，簡(jiǎn)稱(chēng)單增李斯特菌)是一種能使人和動(dòng)物患腦膜炎、敗血癥以及流產(chǎn)等疾病的致病菌，死亡率極高。檢測(cè)單增李斯特菌的常規(guī)方法雖然準(zhǔn)確性好，但所需時(shí)間長(zhǎng)，操作繁瑣，不能滿(mǎn)足當(dāng)前食品安全快速檢測(cè)的要求。分子生物學(xué)方法快速、靈敏、特異性強(qiáng)，但成本較高，且要求較高的技術(shù)水準(zhǔn);大型儀器分析方法[6] 如VITEK(全自動(dòng)細(xì)菌鑒定/藥敏系統(tǒng))、MIS(微生物鑒定系統(tǒng))等，雖然快速準(zhǔn)確、檢測(cè)量大，但儀器費(fèi)用頗高，一般檢測(cè)單位和食品企業(yè)不具備這種條件;免疫學(xué)中ELISA方法，操作簡(jiǎn)便、快速、靈敏，因而廣泛應(yīng)用于致病菌的檢測(cè)。

本研究利用納米材料的光學(xué)性質(zhì)和免疫學(xué)反應(yīng)的特異靈敏性，進(jìn)行了CdS量子點(diǎn)與單增李斯特菌抗體偶聯(lián)的研究，對(duì)單增李斯特菌進(jìn)行了快速檢測(cè)。本方法適用于食品安全的致病菌快速檢測(cè)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

DF101S智能集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(上海東璽制冷儀器設(shè)備有限公司); UV1700紫外分光光度計(jì)、RF5301熒光分光光度計(jì)(日本Shimadzu公司); JEM2010透射電子顯微鏡(日本JEOL LTD公司)、Nikon 80i熒光顯微鏡(日本Nikon公司)。

單增李斯特菌抗體(本實(shí)驗(yàn)室制備); 巰基乙酸(TGA)、硫代乙酰胺(TAA)、CdCl2·2.5H2O、Na2S·9H2O和KOH(分析純，國(guó)藥集團(tuán)); N羥基琥珀酰亞胺(NHS)、1乙基(3二甲基氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl， 分析純，上海晶純?cè)噭┯邢薰?。水為去離子水。

2.2 CdS量子點(diǎn)的合成及條件優(yōu)化

參照并改進(jìn)文獻(xiàn)[7]的方法，合成CdS量子點(diǎn)。在一定溫度下，在100 mL三口燒瓶中加入50 mL 去離子水和1 mL 0.0585 mol/L CdCl2溶液，充氮?dú)獬?0 min后加入TGA，調(diào)節(jié)pH值，繼續(xù)充氮?dú)獬?0 min后加入1mL 0.0585 mol/L Na2S溶液，繼續(xù)通氮?dú)獬趺荛]攪拌后即得水溶性CdS量子點(diǎn)溶膠。稀釋后測(cè)其紫外可見(jiàn)吸收光譜和熒光發(fā)射光譜。按表1所列條件合成CdS量子點(diǎn)。表1 CdS量子點(diǎn)合成的反應(yīng)條件

2.3 CdS量子點(diǎn)的表征分析

(1)透射電子顯微鏡(TEM)表征分析：取少量CdS溶液，用于TEM觀察; (2)紫外吸收分析：取少量CdS溶液進(jìn)行紫外掃描分析，掃描波長(zhǎng)范圍為200～600 nm; (3)熒光光譜分析： 將CdS量子點(diǎn)溶液進(jìn)行熒光光譜掃描。掃描范圍220.0～800.0 nm，激發(fā)波長(zhǎng)： 350.0 nm，激發(fā)狹縫： 5.0 nm， 發(fā)射狹縫： 5.0 nm。

2.4 CdS量子點(diǎn)與單增李斯特菌抗體IgG偶聯(lián)

參照并改進(jìn)文獻(xiàn)[8]的方法。取水溶性量子點(diǎn)/磷酸鹽緩沖液30 μL，加入20 μL 60 g/L EDC·HCl溶液，振蕩混勻，再加入100 μL 0.15 g/L NHS 溶液，20 ℃溫和攪拌0.5 h，在持續(xù)攪拌下與含0.14 mg單增李斯特菌抗體IgG 的磷酸鹽緩沖溶液混合、密閉，20 ℃繼續(xù)攪拌0.5 h。

2.5 偶聯(lián)CdS量子點(diǎn)單增李斯特菌抗體的特性測(cè)定

(1)血清凝集實(shí)驗(yàn)：在潔凈載玻片上滴加一滴偶聯(lián)CdS量子點(diǎn)的單增李斯特菌抗體溶液后，加適量的單增李斯特菌菌體抗原，輕輕晃動(dòng)載玻片使二者混勻，觀察載玻片上是否有凝集的細(xì)小顆粒。待載玻片上的反應(yīng)物自然干燥后用熒光顯微鏡觀察。(2)直接熒光免疫實(shí)驗(yàn)：在潔凈載玻片上滴加適量的單增李斯特菌滅活抗原，自然干燥，在-20 ℃用丙酮固定10～15 min，加偶聯(lián)CdS量子點(diǎn)的單增李斯特菌抗體溶液，37 ℃溫育1 h，取出玻片用蒸餾水洗滌，再經(jīng)0.1%伊文氏蘭染色、洗滌，完全干燥后在熒光顯微鏡下進(jìn)行檢測(cè)。

3 結(jié)果與討論

3.1 CdS量子點(diǎn)的表征分析

本實(shí)驗(yàn)制備的CdS量子點(diǎn)在TEM下觀察(圖1)以單分散形式存在，分散性良好，顆粒均勻呈球形，直徑約5 nm;UVvis分析(圖2)表明，在400 nm處有較強(qiáng)的吸收峰。

圖1 CdS量子點(diǎn)的透射電子顯微鏡照片

Fig.1 TEM photograph of CdS QDs 圖2 CdS量子點(diǎn)的紫外吸收光譜

Fig.2 UVvis absorption spectrum of CdS QDs3.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)量子點(diǎn)粒徑和熒光光譜的影響

隨著制備量子點(diǎn)反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，CdS量子點(diǎn)的紫外吸收產(chǎn)生逐漸紅移現(xiàn)象。量子點(diǎn)的制備反應(yīng)時(shí)間對(duì)量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度有一定影響。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為3 h時(shí)，合成CdS量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度最強(qiáng);反應(yīng)時(shí)間為1 h時(shí)，CdS量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度最弱;當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為2， 4和5 h時(shí)，合成CdS量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度比較接近，處于中等水平。

3.3 [Cd2+]與[S2-]比例對(duì)制備CdS量子點(diǎn)的影響

合成CdS量子點(diǎn)的[Cd2+]與[S2-]的比例不同， 其紫外吸收曲線(xiàn)也有差異。當(dāng)[Cd2+]∶[S2-]=1∶1和2∶1時(shí)，在400 nm處有較強(qiáng)的紫外吸收峰;當(dāng)[Cd2+]∶[S2-]=1∶2時(shí)，在430 nm處有較強(qiáng)的紫外吸收，量子點(diǎn)的紫外吸收曲線(xiàn)很明顯地發(fā)生了紅移。

由表2可知，當(dāng)[Cd2+]∶[S2-]的比例不同時(shí)，制備的CdS量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度也有很大差別。當(dāng)[Cd2+]∶[S2-] =2∶1時(shí)， CdS量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度最大，約為[Cd2+]∶[S2-]=1∶2的13倍，[Cd2+]∶[S2-]=1∶1的5倍; 當(dāng)[Cd2+]∶[S2-]=1∶2時(shí)，CdS量子點(diǎn)的熒光吸收峰發(fā)生明顯紅移效應(yīng)。Cd2+過(guò)量更易得到粒徑小、熒光強(qiáng)度高的CdS量子點(diǎn)。這是由于Cd2+、S2-等在粒子表面發(fā)生了復(fù)雜的吸附作用。根據(jù)Fajans規(guī)則[9]，構(gòu)晶離子將優(yōu)先吸附在粒子表面。CdS 量子點(diǎn)表面通過(guò)靜電吸附這種配合物起到穩(wěn)定作用。而S2-過(guò)量時(shí)，不能形成這樣的包覆層。 表2 [Cd2+]∶[S2-]不同比例制備的CdS量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度

3.4 穩(wěn)定劑對(duì)CdS量子點(diǎn)的影響

膠體法制備量子點(diǎn)常用的穩(wěn)定劑有六偏磷酸鈉(HMP)、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)[10，11]及TGA等巰基類(lèi)化合物[12]。本實(shí)驗(yàn)以TGA為穩(wěn)定劑。隨著穩(wěn)定劑含量的增加，CdS量子點(diǎn)紫外吸收曲線(xiàn)發(fā)生紅移。由表3可知，添加不同體積TGA，合成的CdS量子點(diǎn)在550 ～600 nm之間有熒光吸收，但熒光強(qiáng)度有很大的影響。加入50 μL TGA制備的CdS量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，約是加入100和150 μL TGA的6倍和18倍。表3 不同體積巰基乙酸制備的CdS量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度

由表4可知，當(dāng)體系中的pH值升高時(shí)，量子點(diǎn)的熒光吸收略微出現(xiàn)紅移，而熒光強(qiáng)度則急劇降低。結(jié)果表明，在pH 8時(shí)，CdS量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，約是pH 9和pH 10時(shí)的14倍和22倍。隨著pH值降低，CdS 量子點(diǎn)的熒光逐漸增強(qiáng)。這是由于在較低的pH下，粒子表面高度質(zhì)子化的硫化鈉分子減少了粒子間的氫鍵作用且使粒子ξ電位增加[13]，從而提高了粒子的分散性。表4 不同pH 條件下制備的CdS量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度

3.5 溫度對(duì)合成CdS量子點(diǎn)的影響

在40 ℃下，制備的CdS量子點(diǎn)在400 nm處有較強(qiáng)的紫外吸收，在30 ℃和50 ℃條件下制備的CdS量子點(diǎn)紫外吸收發(fā)生紅移。當(dāng)制備量子點(diǎn)的溫度升高時(shí)，量子點(diǎn)的熒光吸收峰逐漸紅移。如表5所示，反應(yīng)溫度越低，生成量子點(diǎn)的顆粒越小，對(duì)應(yīng)的熒光發(fā)射峰波長(zhǎng)越小;反之，溫度越高，生成量子點(diǎn)的顆粒越大，對(duì)應(yīng)的熒光發(fā)射峰波長(zhǎng)越大。當(dāng)反應(yīng)溫度為30 ℃時(shí)，其熒光吸收峰在560 nm處;反應(yīng)溫度為40 ℃時(shí)，其熒光吸收峰在590 nm處;如果將反應(yīng)溫度升到50℃，其熒光吸收峰轉(zhuǎn)移到700 nm附近。量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度隨著溫度的升高有所降低，30 ℃時(shí)合成的量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，40 ℃和50 ℃時(shí)合成的量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度較為接近，但均比30 ℃時(shí)弱。表5 不同溫度條件下制備的CdS量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度

3.6 CdSIgG的表征分析

由圖3可見(jiàn)，偶聯(lián)單增李斯特菌抗體IgG的CdS量子點(diǎn)仍以單分散形式存在，形態(tài)均勻、呈球形，粒徑大小約為8 nm，較CdS量子點(diǎn)稍大。

單增李斯特菌抗體IgG的紫外吸收光譜(圖4)顯示，在280 nm處出現(xiàn)的強(qiáng)吸收峰，為蛋白質(zhì)的特征吸收峰。CdSIgG偶聯(lián)后只在410 nm處有較強(qiáng)的紫外吸收峰，而蛋白質(zhì)特征吸收峰則消失。

Fig.4 UVvis absorption spectrum of antibody IgG如圖5所示，在682～715 nm處CdS量子點(diǎn)和抗體IgG蛋白以及偶聯(lián)后的CdSIgG均有熒光吸收峰，其中CdS量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度比IgG蛋白略高。但經(jīng)過(guò)偶聯(lián)后，CdSIgG的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，約是單獨(dú)存在時(shí)的4倍。IgG偶聯(lián)的CdS量子點(diǎn)熒光光譜與偶聯(lián)前水溶性量子點(diǎn)相比，發(fā)射波長(zhǎng)(λem)幾乎沒(méi)有變化，說(shuō)明CdSIgG保持了原有水溶性量子點(diǎn)的熒光發(fā)射特性。

圖5 CdS量子點(diǎn)、IgG抗體和CdSIgG熒光光譜

3.7 偶聯(lián)CdS量子點(diǎn)的單增李斯特菌抗體特性的測(cè)定

3.7.1 血清凝集實(shí)驗(yàn) 對(duì)偶聯(lián)CdS量子點(diǎn)的單增李斯特菌抗體進(jìn)行血清凝集實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在抗體與抗原接觸混勻后約30 s，肉眼可清晰看見(jiàn)有固體小顆粒形成，說(shuō)明抗原與抗體發(fā)生了凝集反應(yīng)，偶聯(lián)量子點(diǎn)后的抗體性質(zhì)沒(méi)有發(fā)生變化。在對(duì)反應(yīng)樣品進(jìn)行熒光顯微鏡鏡檢時(shí)，可清楚地看到凝集成團(tuán)的菌體表面有熒光出現(xiàn)(圖6)。

3.7.2 直接熒光免疫實(shí)驗(yàn) 用直接免疫熒光實(shí)驗(yàn)對(duì)單增李斯特菌進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果顯示，加入有熒光CdS量子點(diǎn)標(biāo)記的單增李斯特菌抗體反應(yīng)后，載玻片上的菌體有特異性黃綠色熒光出現(xiàn)(圖7)。

圖6 血清凝集實(shí)驗(yàn)顯微鏡照片(a)和熒光顯微鏡照片(b)

Fig.6 Microscope photograph(a) and fluorescence microscope photograph(b) of SAT圖7 直接免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯微鏡照片(a)和熒光顯微鏡照片(b)

Fig.7 Microscope photograph(a) and fluorescence microscope photograph(b) of direct immunofluorescence4 結(jié) 論

通過(guò)EDC·HCl與NHS的作用，使單增李斯特菌抗體IgG與CdS量子點(diǎn)偶聯(lián)穩(wěn)定，體系的熒光峰位置沒(méi)有發(fā)生變化，但熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，偶聯(lián)CdS量子點(diǎn)的單增李斯特菌抗體的熒光強(qiáng)度是偶聯(lián)前的4倍。結(jié)果證明： 巰基能與硫化鎘產(chǎn)生較強(qiáng)的相互作用。當(dāng)修飾劑與硫化鎘作用加強(qiáng)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致硫化鎘納米微粒的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，這與文獻(xiàn)[14]報(bào)道的結(jié)果一致。通過(guò)血清凝集反應(yīng)和直接免疫熒光實(shí)驗(yàn)證明，偶聯(lián)CdS量子點(diǎn)的單增李斯特菌抗體的特性沒(méi)有發(fā)生變化，在熒光顯微鏡下可快速靈敏地檢測(cè)出單增李斯特菌。由于偶聯(lián)CdS量子點(diǎn)的單增李斯特菌抗體熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，只要樣品中有極少量的單增李斯特菌在熒光顯微鏡下就會(huì)被抗體捕獲到并發(fā)出熒光。