作者：王春梅郭海濤楊家冀黃曉峰陳丹朱妙章

【關鍵詞】 成纖維細胞 關鍵詞: 成纖維細胞;細胞骨架;線粒體;激光掃描共聚焦顯微鏡;大鼠 摘 要:目的 用激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM）觀察培養的乳鼠心成纖維細胞中細胞骨架波形蛋白（vimentun，Vim）、線粒體（mitochondrial，Mi）以及相互關系. 方法 分離純化乳鼠心成纖維細胞，免疫熒光雙標記技術進行了Vim和Mi的標記，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察. 結果 培養的乳鼠心成纖維細胞中Vim位于細胞的胞質中，呈粗細不等的綠色線條狀或絲狀分布，標記明顯，許多細絲交織形成網狀結構.Mi標記為紅色顆粒狀，遍布于細胞質中，Mi的顆粒大小不等，形態不一，可聚集成團，并有明顯的沿著Vim分布的趨勢. 結論 LSCM觀察培養的心成纖維細胞中Vim呈細絲交織形成立體的網狀結構，Mi有沿著細胞骨架Vim分布的趨勢. Keywords:fibroblasts;cytoskeleton;mitochondrion;laser scanning confocal microscope;rats Abstract:AIM To observe the vimentin（Vim），mitochon-drion（Mi）and their interrelationships in the cultured cardiac fibroblast of rat with laser scanning confocal microscope.METHODS The cardiac fibroblasts of rat underwent double labeling of Vim and Mi by immunofluorescence technique after isolation and purification，then were observed with laserscanning confocal microscope.RESULTS Vim was observed in the cytoplasm of cardiac fibroblast of rat clearly，with a distribution of irregular green lines or fila.Most of them dis-played reticular formation.Mi were the red granules，which were universally distributed in the cytoplasm.The size and shape were irregular，either gathered in a mass or distributed along Vim.CONCLUSION Laser scanning confocal micro-scopic observation reveals that Vim is filament-like and can display reticular formation and Mi might be distributed along Vim. 0 引言 激光掃描共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal microscope，LSCM）已廣泛應用于生物醫學的各個領域［1，2］ .但是對于心成纖維細胞中細胞骨架觀察未見報道.了解心成纖維細胞增殖和功能的變化特征，尤其是細胞骨架的分布與變化及與能量供給單位-線粒體的關系，對采取及時的防治措施是十分重要的［3］ .我們采用免疫熒光雙標記技術對培養的心成纖維細胞進行了波形蛋白（vimentun，Vim）和線粒體（mitochondrial，Mi）的標記，用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察了形態和分布以及相互的關系.旨在探討正常培養的心成纖維細胞中Vim和Mi的定性、定位，以及相互的關系，為進一步研究心成纖維細胞的病理變化提供實驗依據. 1 材料和方法 1.1 材料 SD乳鼠（1～2d）:由第四軍醫大學實驗動物中心提供.胰酶:Difco，膠原酶:EDTA，DMEM培養基及小牛血清:Gibco;線粒體標記物Mito-Tracker（Gene Co Ltd1∶10000），波形蛋白標記物（Dako Vimentun1∶50），羊抗小鼠IgG-FITC. 1.2 方法 心成纖維細胞培養與鑒定與郭海濤等［4］ 方法相同.將載有心成纖維細胞的蓋玻片pH7.4的PBS（37℃）沖洗1～2min3次，加入MitoTracker（37℃）15～45min，pH7.4的PBS沖洗3次，用4℃丙酮固定10～15min.pH7.4的PBS沖洗3次，加鼠抗波形蛋白45～60min37℃或4℃過夜.pH7.4的PBS洗3次，加FITC標記的羊抗小鼠IgG（武漢博士德生物工程公司，稀釋度1∶50）37℃孵育45～60min或4℃過夜.pH7.4的PBS洗3次，無熒光緩沖甘油封片.對照用無關抗體以及正常兔血清取代一抗染色作為抗體特異性對照，用PBS替代一抗作為陰性對照，省略一抗作空白對照.所用LSCM型號為Bio-Rad MRC-1024，用于FITC的激發波長為488nm，568nm用于激發Mi.用于圖像采集的顯微鏡物鏡為Plan-Neofluar40×油浸鏡，數值孔徑（NA）為1.3.圖像存為512×512相素類型.ZOOM設為1.0.若需要更大的放大倍數時，可以選擇更大的ZOOM范圍.掃描所用的激發值依據樣本的不同可以在共聚焦系統提供的梯級值中選擇. 2 結果 2.1 心成纖維細胞波形蛋白 呈粗細不等的綠色線條狀或絲狀分布，標記明顯，位于細胞的胞質中，單個細胞的許多細絲交織形成網狀結構（Fig1）. 2.2 心成纖維細胞線粒體 標記為紅色顆粒狀，遍布于細胞質中，線粒體的顆粒大小不等，形態不一，可聚集成團（Fig2）.