作者：馬立娜 劉殿駿 王振新

【摘要】 由于金納米粒子（AuNPs）具有與大小、形狀和聚集程度相關的物理和化學特性，被廣泛應用于各種生物分析和生物醫學檢測技術中，并發展成具有高選擇性、高靈敏度的生物分析檢測手段。以AuNPs為探針的分析方法通常具有簡單、快速、靈敏度高的優點，并能應用于實際樣品檢測。本文綜述了目前生物分子修飾的AuNPs探針的合成及其在檢測金屬離子、小分子、DNA、蛋白質和細胞內分析等方面的應用。

【關鍵詞】 金納米粒子；探針；合成與修飾；評述

Abstract During last decade，gold nanoparticled(AuNPs)-based assays have been well-developed and widely used in biological analysis and biomedical detection because AuNPs have unique physical and chemical properties which depend on the size，shape and degree of aggregation.The AuNPs-based assays have already been employed for detecting practical samples with high simplicity and selectivity.This review discusses the recently development of the synthesis and biological molecular functionalisation of AuNPs and their applications on the heavy metallic cations，small organic compounds，nucleic acids and proteins detection and cellular analysis.

Keywords Gold nanoparticles；Probe；Synthesis and functionalization；Chemical sensing；Review

1 引言

納米技術與化學、生物學、物理學和醫學等領域的結合，對分析科學和生命科學領域的超靈敏檢測和成像方法的發展起著越來越重要的作用[1~5]。由于AuNPs具有獨特的光學性質（表面等離子體吸收和共振光散射）、易進行表面修飾以及良好的生物相容性（通常認為裸AuNPs是無生物毒性的，而修飾后的AuNPs的生物毒性由其配體決定），因此功能化AuNPs的應用領域不斷被拓寬，特別是其在生物分析和生物醫藥等領域的應用引起了人們廣泛關注[2，3]。本文綜述了生物分子修飾的AuNPs探針的合成及其在檢測金屬離子、小分子、DNA、蛋白質和細胞內分析等方面的新進展，以若干應用實例突顯一些技術突破及發展趨勢。

2 金納米粒子的合成、穩定性和功能化

2.1 金納米粒子的合成方法

金納米粒子的制備方法可分為化學法和物理法。化學法是以金的化合物為原料，在還原反應生成金納米粒子時控制粒子的生長，使其維持納米尺度。化學合成法包括氧化還原法、電化學法、晶種法、模板法、微乳液法、微波合成法和光化學法等[2]，其中最具代表性并被廣泛應用的有：（1）Turkevich-Frens法[6，7]，即在100 ℃下，通過改變還原劑（檸檬酸鈉）和三價金的化合物（氯金酸或氯金酸鈉）的比例來控制AuNPs粒徑的大小，從而獲得粒徑在10~60 nm范圍內且分散性較好的AuNPs。該方法制備程序簡單，且包裹在AuNPs表面的檸檬酸根容易被其它配體置換（如巰基修飾的DNA等）[2，4]；（2）Brust-Schiffrin法[8，9]，即在兩相（液/液）體系或單相體系中，以四正辛基溴化銨（TOAB）為相轉移劑，將三價金的化合物（氯金酸或氯金酸鈉）轉移到有機相中，以烷基硫醇為穩定劑，NaBH4為還原劑，制備粒徑為1~8 nm的AuNPs；硫醇/金鹽的比例越大、加入還原劑速度越快，冷卻溶液可以制得尺寸更小和單分散性更好的粒子，進一步通過配體交換反應改變AuNPs表面的配體而實現其功能化；（3）聚合物保護法：通常以含有聚乙二醇、硫醇或硫醚基團的聚合物為配體，以NaBH4為還原劑，制備水溶性或具有疏水性的粒徑小于10 nm的AuNPs。聚合物穩定劑決定納米粒子的溶解性；例如，文獻[10，11] 采用硫醚或硫醇修飾的聚合物配體（烷基硫醚終端修飾的聚甲基丙烯酸等）一步法合成了具有高分散性的粒徑小于5 nm的AuNPs，粒子的大小和分散性可以通過改變聚合物的結構、濃度和配體上能與金屬結合的基團個數來控制，并且可以將粒徑為1.1~1.7 nm的無熒光納米粒子轉變為熒光納米粒子。

物理法是利用各種技術將塊狀固體金分散為金納米粒子，包括真空沉積法、電分散法、激光消融法等[12]。物理法容易控制AuNPs的形狀并能獲得圖案化的AuNPs的陣列，但通常需要特殊的設備和技術，制備過程較復雜。

2.2 金納米粒子的穩定性和功能化

將不同的識別分子（如功能基團）修飾到AuNPs上，獲得功能化納米粒子（AuNPs探針），有助于拓寬AuNPs的應用范圍，發展基于AuNPs的分析/檢測方法。已有很多文獻對金納米粒子的功能化及應用進行了綜述[1~5，13]。在介質中保持單分散性和穩定性是AuNPs在實際應用中的關鍵。因此，人們不斷尋找新型穩定劑和修飾方法以提高AuNPs的分散性。這些方法將有助于改善方法選擇性和準確度，其中最具代表性的方法[1]如圖1所示。在生物分析中可以應用靜電吸附法、共價偶聯（AuS共價結合等）法和特異性識別法（抗體-抗原，生物素-親和素，DNA雜交等）將生物分子修飾到AuNPs表面，合成AuNPs探針。

圖1 金納米粒子探針合成示意圖[1]（略）

Fig.1 Schematic representation of formation of gold nanoparticle probes[1]

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將配體通過靜電吸附作用固定在AuNPs表面的方法簡單、省時[3]，但是配體與AuNPs結合強度小，穩定性差。如果反應緩沖溶液中含有二硫蘇糖醇（DDT，含有兩個巰基、不帶電的小分子，常用作蛋白保護劑）或在高鹽緩沖溶液（一般用于DNA雜化實驗）進行長時間的孵育時，表面不穩定的AuNPs探針很容易產生非特異性結合，從而降低了檢測的選擇性。

與靜電吸附法相比，共價偶聯的方法較復雜，需要進行更多的配體合成工作。但是，配體與AuNPs通過共價鍵結合穩定性好。在共價偶聯中通常以Au-S共價結合獲得AuNPs探針，這種方法必須使用含有S的配體，如硫醇或二硫化物修飾的DNA、多肽CALNN等[1~5，13~15]，通過共價法獲得的AuNPs探針可以承受很高的鹽濃度（2 mol/L NaCl）， 并在某種程度上可以抵抗二硫蘇糖醇或帶巰基或氨基的分子的攻擊。特別是將具有雙親性的配體（有S端具有疏水性，另一端具有親水性，如烷基硫醇修飾的聚乙二醇、多肽CALNN等）通過共價鍵法修飾到AuNPs上，在其表面形成疏水-親水層，將極大提高AuNPs在水溶液中的穩定性。

利用某些生物分子之間的特異性識別，如，（1）鏈霉親和素修飾的AuNPs可以結合生物素化的蛋白（如免疫球蛋白和血清蛋白）或寡聚核苷酸[16]；（2）蛋白A修飾的AuNPs用于連結不同免疫球蛋白的Fc碎片[17]；（3）糖修飾的AuNPs用于識別其相應的結合蛋白，也可以設計功能化的AuNPs探針。

3 金納米粒子探針的應用

3.1 重金屬離子檢測

基于AuNPs的比色法已經被廣泛應用于有毒重金屬離子（Pb2+，Cd2+和Hg2+等）的檢測[18，19]，這種方法克服了傳統方法中諸如使用有機溶劑、光敏感的染料分子，實驗過程繁瑣以及儀器操作復雜等缺點。Wang等[19]研制出基于DNAzyme修飾的AuNPs比色傳感器，可以快速、簡單、實時及線性范圍可調地檢測Pb2+（見圖2）。他們選擇對Pb2+有高特異性識別的DNAzyme，DNAzyme由底物鏈和識別鏈組成。底物鏈5′末端和識別鏈3′末端分別連有8個互補堿基做為延長鏈，兩個互補堿基鏈可以使底物鏈和識別鏈在特定的溫度下穩定雜交，同時也能夠保證在Pb2+存在時，后者將DNAzyme另一端分裂后釋放出單鏈DNA(ssDNA)。該體系在Tris和NaCl調節離子強度后加入AuNPs，當Pb2+存在時，Pb2+作用于DNAzyme的識別位點將ssDNA釋放出來并與AuNPs結合，阻止后者聚集，而使溶液呈現納米金單分散狀態的紅色。沒有Pb2+或有其它金屬離子存在時，不發生分裂反應，加入的AuNPs無ssDNA保護而發生聚集，溶液變為藍紫色。這種傳感器對Pb2+的檢出限為3 nmol/L，遠遠低于美國環境保護局（EPA）對飲用水中Pb2+濃度的檢出限[18，19]。Li等[20]報道了另一種基于DNA修飾的AuNPs探針檢測Hg2+的比色方法，這種方法靈敏度更高，檢出限可達1 nmol/L。Xue[21]和Lee[22]等依據Hg2+可與胸腺嘧啶形成T-Hg2+-T復合物，建立了一種高靈敏性和高選擇性檢測Hg2+的方法，即在特定溫度下因Hg2+誘導DNA修飾的AuNPs聚集狀態的改變導致溶液顏色改變來檢測Hg2+。如果使用對其它金屬離子具有選擇性的堿基對取代胸腺嘧啶，可實現對其它金屬離子的檢測。

圖2 （a）左圖：包含識別鏈17E(8)和底物鏈(8)17S的DNAzyme，右圖：非標記的比色傳感器；（b）pH=7.2時，加入不同濃度的Pb2+后AuNPs溶液的顏色變化圖，線性范圍0.003~1.0 μmol/L；（c）pH=5.5時，加入不同濃度的Pb2+后，AuNPs溶液的顏色變化圖，線性范圍0.120~20 μmol/L [19]（略）

Fig.2 (a) Left：secondary structure of DNAzyme complex，which consists of an enzymestrand(17E(8)) and a substrate strand((8)17S).Right：schematic of label-free colorimetric sensor.Color change of the gold nanoparticle(AuNP) solution with different concentrations of lead in the solution at pH 7.2(b) and 5.5(c)；the dynamic range of the assay is 3 nmol/L to 1 μmol/L at pH 7.2 and 120 nmol/L to 20 μmol/L at pH 5.5，respectively [19]

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3.2 小分子檢測

將對特定小分子具有親和性的官能團修飾到AuNPs表面，可發展基于AuNPs的應用于小分子檢測的比色法[23]。Ai等[24]基于分子識別原理，建立了原奶和嬰兒配方奶中三聚氰胺的檢測方法，無需借助任何儀器，1 min內裸眼檢出限可達20 nmol/L。最近，發展基于適配子（通過體外篩選技術“指數級富集的配體系統進化技術（SELEX）”）修飾的AuNPs比色法并應用于小分子（腺苷，可卡因等）檢測也引起了人們的廣泛關注[25，26]，如Wang等[27]用適配子修飾的AuNPs設計了一種“Preudo”夾心反應，通過SPR光譜檢測小分子（腺苷）。

3.3 DNA檢測

DNA修飾的AuNPs與目標DNA雜交后可以形成有序的聚集體，溶液顏色發生改變，從而實現對目標DNA的檢測。已有大量文獻對基于AuNPs比色法檢測DNA及其在生物傳感器、疾病診斷、基因表達等方面的應用進行了報道和綜述[1~5]。結合相應的光/電分析方法，人們還發展了一系列新的基于DNA修飾的AuNPs的檢測手段。Hill等[28]以DNA修飾的AuNPs為探針，將生物條形碼方法和微流體芯片技術相結合，建立了一種新的生物條形碼分析法（基因組的條形碼分析方法），快速、精確地檢測DNA。這種方法使用阻斷鏈抑制靶標物再次雜交，可以檢測雙鏈基因組DNA（見圖3）。這項工作為生物條形碼方法從實驗室到實際應用開辟了道路。Dai等[29]結合動態光散射（DLS）技術，提出了基于AuNPs探針一步法高靈敏性檢測同源DNA的方法。該方法操作簡單且無需分離和信號放大步驟，檢出限約1 pmol/L，優于其它光吸收法4個數量級，并可以很容易地區分單堿基對錯配DNAs和完全匹配的靶標物DNAs。Zhang等[30]研制出一種基于三明治結構的脫氧核糖核酸計時電量傳感器（CDS）。將一個單鏈DNA探針固定在金電極上，每個探針側面與一個或兩個靶序列的碎片相連，然后浸入含有目標單鏈DNA分子的溶液中，此時電極上單鏈DNA探針與溶液中互補序列的目標DNA單鏈分子雜交并用DNA修飾的AuNPs進行信號放大，用計時電位法觀察[Ru(NH3)6]3+與單鏈DNA的靜電吸附情況（見圖4）。

圖3 (a）基因組的條形碼分析方法示意圖[28]；（b）掃描芯片圖，檢出限為2.5 fmol/L；（c）5次平行實驗得出的掃描信號密度數據（略）

Fig.3 (a) Schematic representation of Genomic Bio Bar Code Assay.For details of the assay，readers are advised to see Ref.[28]；(b) Representative slide from a single assay showing that 2.5 fmol/L is distinguishable from the 0 fmol/L(no target) sample；(c) The data shown above are the average of 5 independent runs of the genomic DNA bio bar code assay[28].

Copyright ACS and reproduced with permission 圖4 CDS法檢測DNA示意圖（a）巰基修飾的單鏈DNA捕獲探針在金電極上自組裝；（b）單鏈DNA探針與溶液中互補序列的目標DNA單鏈分子雜交，一個捕獲探針只能與一個目標分子雜交；（c）DNA結合AuNPs放大檢測信號，AuNPs上成百上千的DNA探針可與目標分子雜交[30]（略）

Fig.4 Chronocoulometric DNA sensor(CDS) strategy for DNA detection.(a) Gold electrode self-assembled with thiolated capture probe DNA and spacer molecule，MCH.(b) DNA hybridization brings target DNA to the electrode surface.Of note，in the absence of amplification，one capture probe only captures one target molecule at the most.(c) AuNP-amplified DNA detection.One hybridization event brings an AuNP loaded with hundreds of reporter probes proximal to the electrode[30]

Reproduced with permission from Nature Publishing Group（略）

3.4 蛋白質分析

AuNPs與蛋白質結合獲得用于電子顯微鏡的AuNPs探針，在電子顯微鏡甚至光學顯微鏡水平上對抗原、抗體進行定位、定性及定量研究，是AuNPs應用于免疫細胞和組織化學的重要里程碑[2，3，31，32]。利用AuNPs的光學和電化學性質結合不同的檢測技術同樣可以檢測蛋白質[33，34]。最近，Gupta等[31]設計了一種吸附可控的動力學模型，實現了對稀溶液中抗原的有效檢測。Ambrosi等[33]合成了一種新的基于人抗IgG過氧化酶（HRP）修飾的雙編碼AuNPs（DC-AuNPs）探針，探針與抗體結合后增強了分光光度法和電化學法檢測人抗IgG信號，檢出限遠遠低于通過酶聯免疫吸附法（ELISA）[33]。依據相同的檢測原理，Cui等[34]設計了AuNPs/碳納米管（CNT）雜化平臺，用辣根過氧化酶修飾的AuNPs探針檢測人IgG。

分子與AuNPs結合后可以增強拉曼信號，據此可以利用AuNPs作底物，通過基于表面增強拉曼效應（SERS）的光譜分析法來快速檢測蛋白-蛋白之間相互作用[35~38]。Manimaran等[35]用熒光素修飾的AuNPs結合人抗IgG檢測1~100 mg/L 人IgG。Li等[36~38]提出了基于SERS的芯片分析法檢測蛋白-抗體之間的相互作用，即將多肽結合到AuNPs上，然后銀染將信號放大，再用拉曼光譜進行檢測。基于適配子（Aptamer）修飾的AuNPs也可以用來檢測蛋白質。Wang等[39]研制出基于Aptamer-AuNPs的比色傳感器，通過Aptamer和α-凝血酶的反應檢測α-凝血酶，這種傳感器具有高靈敏性和高選擇性，可以檢測人血漿中的蛋白。

酶的活性檢測和動力學參數分析是生物分析和生物醫學的一個重要課題。研究人員結合AuNPs的光學和電學性質提出了許多新的檢測酶活性的方法[40~44]。文獻[14]詳盡闡述了AuNPs探針用于分析蛋白激酶和蛋白磷酸酶的新進展。Xu等[44]用AuNPs作指示劑，分析DNase Ⅰ酶的活性并篩選酶抑制劑。該方法可以通過裸眼觀察，并且能高通量的篩選核酸內切酶的抑制劑。根據AuNPs的生物催化過程，Willner研究組設計了幾種納米粒子-酶（葡萄糖氧化酶（GODx）、乙醇脫氫酶(NAD(P)+-dependent enzyme)、乙酰膽堿酯酶[40]和酪氨酸酶等）雜化膜電化學傳感器，通過酶催化反應增大電極上AuNPs的粒徑使其導電性顯著地增強，加速了GODx電子的轉移[45~49]。

3.5 細胞分析

利用AuNPs獨特的光學性質及良好的生物相容性還可以進行細胞表面和細胞內多糖、蛋白質、多肽、抗原、激素、核酸等生物大分子的精確定位，因而在臨床診斷及藥物檢測等方面受到廣泛關注[13，50]。癌癥的早期精確檢測通常需要昂貴的儀器且耗時，為了克服這些缺點，Medley等建立了一種可直接檢測癌細胞的比色分析法[50]。這種方法將Aptamer的高選擇性和高親和性與AuNPs的光譜性質相結合，高靈敏地檢測癌細胞。在癌細胞存在的情況下，加入Aptamer修飾的AuNPs探針，樣品溶液顏色能發生明顯的變化，可以通過裸眼直接觀察，獲得相對靈敏的檢測結果[51，52]。Kneipp等[52]在AuNPs探針存在下測得了活體上皮細胞膜和巨噬細胞的表面增強拉曼（SERS）光譜，并結合TEM等表征手段分析細胞內物質。

4 結論和展望

AuNPs因其具有特殊的穩定性、小尺寸效應、量子效應、表面效應和良好的生物親和效應等，已被廣泛應用于化學和生物學研究。生物分子修飾AuNPs探針拓寬了AuNPs的應用范圍，然而，AuNPs探針的應用仍然有許多亟待解決的問題，如實驗結果的可重復性，合成方法的可靠性，AuNPs的使用壽命以及修飾后的AuNPs的生物相容性等。可以相信，通過各學科研究者的共同努力，一定能克服AuNPs探針的缺點，研制出新型簡單、高靈敏度和高選擇性的分析方法，從而實現其在實際樣品，特別是臨床樣品檢測中的應用。