作者：李娜 喬光明 禚林海 唐波

【摘要】 聚合酶鏈式反應（PCR）技術是現代分子生物學核心技術之一，研究提高PCR擴增效率的方法具有重要意義。傳統提高PCR擴增效率的方法具有較多局限性，使得PCR擴增仍不能達到理想的效果。隨著納米技術的發展，納米材料具有特殊的表面效應和尺寸效應，表面能進行多種修飾，易與生物大分子蛋白質、核酸等相互作用，對生物分子的結構和功能產生特別的影響。研究利用納米材料來提高PCR擴增效率的技術和方法，具有非常重要的理論意義和應用價值。本文引用文獻41篇，綜述了近年來納米材料在PCR體系中應用的現狀，并展望了今后納米材料在PCR體系中應用的發展方向及其前景。

【關鍵詞】 聚合酶鏈式反應；納米材料；特異性；擴增效率；評述

Application Progresses of Nanomaterials on Polymerase Chain ReactionLI Na，QIAO Guang-Ming，ZHUO Lin-Hai，TＡＮＧ Bo*(College of Chemistry，Chemical Engineering and Materials Science，Key Laboratory of Molecular and Nano Probes，Ministry of Education，Engineering Research Center of Pesticide and Medicine Intermediate Clean Production，Ministry of Education，Shandong Normal University，Jinan 250014)Abstract Polymerase chain reaction possesses very important academic and application meanings to study the ways and technologies of improving the efficiency of PCR based on nanomaterials.In this review，recent application status of nanomaterials on PCR was summarized with 41 references.Particularly，the developing trends and prospects in the future were also discussed.Keywords Polymerase chain reaction； Ｎanomaterials； Ｓpecificity； Ａmplication efficiency； Ｒeview

1 引言

1983年Mullis發明了聚合酶鏈式反應(PCR)[1]，并因此榮獲1993年諾貝爾化學獎。PCR可使目的DNA分子的合成量呈指數增長，因此微量的遺傳物質在數小時內即能擴增數百萬倍[2，3]達到檢測水平，進而可進行測序[4]、DNA探測[5，6]、基因分析[7~9]、食品檢驗[10，11]、環境監測[12，13]等。PCR技術具有特異、敏感、快速、易自動化等突出優點，徹底改革了分子遺傳學，成為現代生物學和藥物科學最流行的技術之一，與克隆、DNA序列分析方法構成了整個現代分子生物學研究工作的基礎。盡管PCR已發展成為一項相當成熟的技術，但在實際操作中，PCR擴增始終存在一些難以克服的問題，如假陰性、假陽性、非特異性擴增以及片狀拖帶或涂抹帶等，尋找解決PCR中這些問題的方法至關重要，通常的辦法有向PCR體系中添加各種增效劑[14，15]，優化PCR體系的各種參數[16，17]，改進PCR的擴增策略[18，19]等，這些方法雖然在一定程度上提高了PCR的特異性、產量以及效率，但是并未徹底解決上述難題，PCR擴增仍達不到理想的預期效果。近年來，人們試圖從新興學科與技術中尋找優化PCR的方法。納米生物技術由于其獨特的優勢性越來越受到人們的關注[20]。尺寸小于100 nm（與生物分子的尺寸相當）的納米材料在生物醫學中得到了廣泛的應用[21，22]，人們已將多種納米材料引入傳統的PCR技術中。

2 納米材料對PCR體系的影響

2.1 金納米粒子對PCR體系的影響

Li等[23]將10 nm的金納米粒子作為一種新型的優化劑添加到PCR體系中，考察了金納米粒子對PCR特異性的影響。實驗結果發現，當金納米粒子的濃度介于0.4～0.8 nmol/L之間時，隨著金納米粒子濃度的不斷增高，PCR的特異性越來越好；但當金納米粒子濃度大于1.0 nmol/L時，PCR的特異性又被抑制。而且，加入金納米粒子在保持PCR產量和特異性的前提下，可以拓寬PCR體系的退火溫度范圍，退火溫度即使低至25 ℃，PCR仍具有較好的特異性。Li等[23]認為金納米粒子模擬了體內DNA復制過程中單鏈結合蛋白SSB的作用，選擇性地結合了單鏈DNA，而不是雙鏈DNA，從而顯著降低了DNA復制過程中引物和模板的錯配。此前，Perales等[24]通過模擬生物體內的擴增策略，成功地將耐熱的SSB蛋白引入到PCR體系中，提高了PCR的特異性。

Vu等[25]深入探討了金納米粒子對PCR體系特異性的影響。發現金納米粒子的作用不是增加PCR的特異性，而是更有利于小片段產物的產生，抑制大片段產物的產生，不論該小片段產物是特異性產物還是非特異性產物。而且，隨著金納米粒子濃度的增加，這種作用越來越明顯。他們認為金納米粒子能促進小片段的擴增，是因為納米金與聚合酶發生了非特異性結合，是表面化學作用起到重要作用。

Li等[26]研究了13 nm的金納米粒子對PCR體系效率的影響。實驗表明，金納米粒子能使PCR體系的產量提高104～106倍，反應時間越短，金納米粒子對PCR體系產量的提高就越明顯。而且，相同量的金納米粒子對不同升降溫速度的PCR體系的影響不同。與不加金納米粒子的PCR體系相比，金納米粒子對升/降溫速度為20 ℃/S的實時PCR產量的提高可高達104倍， 而對升/降溫速度為2 ℃/S的普通PCR體系， 金納米粒子對其產量的提高只有5～10倍，PCR體系的熱循環越快，金納米粒子對PCR產量的提高就越大。Li等[26]認為，金具有良好的熱傳導性，改善了快速升降溫PCR體系的熱傳導性，有利于模板與引物更高效的配對，從而提高了PCR的產量，優化了PCR體系。

對于金納米粒子與PCR各參數的相互作用，文獻[27，28]報道了引物共價鍵合到金納米粒子表面的PCR。結果表明，一條引物（上游引物或者下游引物）或者兩條引物連接到金納米粒子上，在一定范圍內，退火溫度對PCR體系幾乎沒有影響，PCR特異性均較好。

米麗娟等[29]研究PCR體系中納米金與DNA聚合酶的相互作用機制時發現，過量的納米金之所以會抑制PCR擴增，是因為納米金與聚合酶發生了相互作用。若提高聚合酶用量，可有效消除金納米粒子的這種抑制作用。在PCR體系中，納米金通過與游離的DNA聚合酶的可逆結合，動態調節聚合酶的濃度，進而影響PCR的擴增結果。但該機理僅從納米金與聚合酶的相互作用出發，考慮到PCR體系的復雜性，納米金還有可能與模板、引物等發生了復雜的相互作用，更為確切的調控機制有待深入研究。

納米金還可以優化PCR的擴增策略。 Pan等[30]研究基于納米金的多輪擴增發現，由于納米金可以抑制PCR的非特異擴增，可以將PCR的有效擴增極限推到第7輪，即使在第6輪擴增中也能得到單一明亮的目標條帶。而在常規PCR多輪擴增中，無論對DNA模板如何稀釋，有效擴增只能進行到第3輪，且隨著擴增輪數的增加，目標產物的量也呈下降趨勢。納米金輔助的PCR再擴增和多輪擴增在一定程度上可取代巢式PCR，避免了巢式PCR需要設計兩對引物的繁瑣。實驗還發現，表面修飾了BPS、莖環DNA、以及Triton-100的金納米粒子，雖然表面性質發生了改變，但是仍然能提高PCR的特異性和產量。

2.2 銀納米粒子對PCR體系的影響

王群等[31]探討了銀納米粒子對PCR體系長片段DNA反復擴增的特異性的影響。實驗結果表明，對長度為3~6 kb的較長片段基因，銀納米粒子在一定程度上保持了其PCR反復擴增的特異性；而對10 kb以上更長片段的反復擴增，銀納米粒子對其特異性的影響比較小。他們認為，可能是銀納米粒子性改善了常規PCR體系溶液的導熱性能，縮短了整個體系達到溫度平衡所用的時間，從而抑制了非特異擴增；也可能是銀納米粒子與不同狀態DNA分子發生了選擇性結合，從而提高了擴增的特異性。 2.3 磁性納米粒子對PCR體系的影響

Shen等[27，32]研究了將引物共價鍵合到SiO2包覆的γ-Fe2O3磁性納米粒子表面的PCR。實驗結果表明，引物連接到γ-Fe2O3磁性納米粒子表面，在合適的條件下，PCR反應能順利進行。當一條引物（上游引物或下游引物）連接在γ-Fe2O3磁性納米粒子表面，而另一條引物（下游引物或上游引物）未連接時，PCR幾乎不受退火溫度的影響；但當兩條引物都連接在γ-Fe2O3磁性納米粒子表面時，PCR受退火溫度的影響較大。在一定溫度范圍內，退火溫度越高，PCR產物特異性越好。而且，將引物與磁性納米粒子連接，產生了新的基于磁性納米粒子的不對稱PCR和對稱PCR。一條引物連接到磁性納米粒子表面的不對稱PCR擴增可以產生大量磁性納米粒子-單鏈DNA復合物，由于單鏈DNA產物連接在磁性納米粒子的表面，所以利用外磁場作用可以很容易地將其分離；而兩條引物均連接到磁性納米粒子表面的對稱PCR擴增，產生了一種生產納米結構聚合物的新方法。

2.4 納米碳對PCR體系的影響

2.4.1 納米碳管對PCR體系的影響 Cui等[33]發現單壁碳納米管（SWNTS）能對PCR產生積極的影響。當SWNTS濃度小于3 g/ L時，能增加PCR擴增的產量；而當SWNTS濃度大于3 g/L時，又會抑制PCR反應。此外，SWNTS還可以在一定程度上模擬PCR緩沖液中Mg2+的重要作用。當PCR反應液中沒有Mg2+時，加入SWNTS能得到與Mg2+存在時相似的效果，PCR的產量沒有太大的差別，都是在SWNTS濃度為3 g/L時得到最大產量。為了探求實驗的機理，他們將SWCNTS分別與DNA、Taq酶進行了孵育，結果發現這些反應成分聚集在SWCNTS周圍，能更好的接觸而發生反應，因而能提高PCR的效率，增加PCR反應的產量。當SWNTS濃度過高時，因其對PCR反應成分的過多連接而破壞了DNA，Tag酶以及引物的反應條件，從而抑制了PCR反應。而且通過X-射線電子光譜圖分析發現，在PCR反應后，SWCNTS的結合能增加，說明其與DNA模板、Taq聚合酶發生了強烈的反應，SWCNTS與PCR各反應成分發生了電子轉移，充當了電子受體和聚合酶的穩定劑。

2.4.2 納米碳粉對PCR體系的影響 Zhang等[34]發現納米碳粉（CNP）的水懸浮溶液能提高重復PCR和長片段PCR擴增的特異性。在沒有CNP的情況下，重復PCR在第4輪擴增就開始出現非特異性條帶。第5和第6輪擴增出現了明顯的拖尾，幾乎沒有目標條帶。而加入適量的CNP懸浮液后，PCR即使到了第6輪擴增也能得到單一的目標條帶。同時，在長片段PCR擴增中加入CNP懸浮液可以使拖尾現象顯著減少，非特異條帶逐漸消失。但是，CNP的濃度必須在一定范圍內才會有效，濃度太低不能有效提高PCR的特異性，濃度過高又會抑制PCR反應。原子力顯微鏡結果說明CNP與雙鏈DNA之間存在潛在的結合力，因此反應的機理可能是這種結合力減少了引物與DNA模板之間的錯配以及引物二聚體的產生，因而可以提高PCR的特異性。但過高濃度的CNP會產生過高的結合力，又會阻礙PCR的反應。但是CNP對PCR有這樣的影響，還有可能是CNP與DNA聚合酶發生了相互作用，反應機理尚需進一步探討。

2.4.3 富勒烯（C60）對PCR反應的抑制作用 張捷等[35]研究了富勒烯(C60)對PCR的影響。隨著C60濃度的增加，PCR擴增被顯著抑制。C60一方面會抑制DNA聚合酶的活性，且濃度越高，抑制作用越大，另一方面又會損傷DNA單鏈模板，降低DNA單鏈模板起始濃度，從而造成PCR產物量的降低。他們認為，這是C60與DNA聚合酶的酶活性位點發生了相互作用，導致DNA聚合酶活性降低，同時C60還會結合到DNA單鏈模板上，干擾引物、底物與模板之間的精確配對，另外，C60可在PCR實驗條件下活化生成多種活性氧或自由基，進而造成DNA聚合酶構象的改變以及DNA模板的損傷，抑制了PCR反應的進行。

2.5 半導體納米材料對PCR體系的影響

Nie等[36]發現表面帶氨基的SiO2包覆的四足狀ZnO納米結構能提高PCR擴增的產量。由SiO2包覆的四足狀ZnO，當表面有氨基修飾并且加入量由0.01 μg逐漸增大到0.5 μg時，PCR產物的量不斷增多；當加入量＞0.5 μg時，PCR產物的量卻不再增加。表面修飾了氨基的ZnO納米結構在一定濃度范圍內能提高PCR擴增的產量。當表面沒有氨基修飾，ZnO納米結構的量≤0.06 μg時，PCR產物的量變化不大；而當ZnO納米結構的量≥0.12 μg時，PCR產物的量減少。其反應機理還不明確。

Wang等[37]考察了表面修飾了羧基的CdTe量子點對PCR體系特異性的影響。實驗結果表明，在不同的退火溫度下，CdTe量子點能提高PCR體系的特異性，而且在擴增短片段時，量子點對PCR體系特異性的提高比擴增長片段時提高的更明顯。同時，CdTe量子點不能提高PCR的效率。CdTe量子點可以作為常規PCR的優化因子，尤其是對多重PCR，因而可以拓寬PCR的應用范圍，同時也對基因診斷具有重要的意義。他們認為反應機理可能有兩方面：（1）與金納米粒子相似，CdTe量子點模擬了體內DNA復制過程中單鏈結合蛋白SSB的作用，選擇性地結合了單鏈DNA，從而顯著降低了DNA復制過程中引物和模板的錯配，有利于提高PCR的特異性；（2） CdTe量子點可能與DNA聚合酶發生了相互作用，聚合酶吸附到量子點的表面，使PCR體系中聚合酶的有效濃度降低，從而有利于目標產物的產生，提高了PCR的特異性。但隨著量子點的不斷增多，聚合酶濃度不斷降低，當聚合酶濃度小于特異擴增需要的有效濃度時，量子點的加入又會對PCR產生抑制作用。

另外，還有不少學者研究了半導體納米材料對PCR體系的抑制作用。早期有學者將微米級的硅顆粒以及表面經過處理的硅加入到PCR體系中[38，39]，發現微米級的硅對PCR過程有較明顯的抑制作用。王瑋等[40]將納米級的硅引入PCR體系中，探討了表面氧化程度不同的硅納米顆粒對PCR擴增的抑制作用及其機理。實驗結果表明，隨著硅材料表面積與PCR反應體系體積比的增大，核酸擴增效率明顯下降；并且在所研究的范圍內，表面氧化程度越高的硅納米顆粒對PCR的抑制作用越強。對抑制作用機理的初步研究表明， 硅納米顆粒對PCR反應液中Taq酶的吸附是導致抑制現象產生的主要原因。而對模板的吸附對PCR的影響較小，而且，硅納米顆粒本身對PCR沒有明顯的直接化學抑制作用。

李世強等[41]考察了在避光條件下，銳鈦礦型納米TiO2對PCR體系的影響，結果表明，納米TiO2對PCR體系有抑制作用。隨著納米TiO2量的增加，對DNA合成的抑制也越強，且抑制作用強于微米級的TiO2。將預先分別與納米TiO2作用的聚合酶、引物和模板加入到PCR體系中，聚合酶的上層清液、引物的沉淀、模板的上層清液與沉淀均有 DNA的合成，但合成量均小于納米TiO2直接加入PCR的DNA的合成量。他們認為在避光下，銳鈦礦型納米TiO2抑制DNA合成的主要原因是納米TiO2具有高的比表面積，對聚合酶、引物和模板存在較強的吸附作用， 對引物的吸附作用最強，對聚合酶的吸附最弱。

3 總結與展望

將納米材料引入到聚合酶鏈反應中，可以同時發揮納米材料和DNA的優點，極大地拓寬PCR技術的應用范圍。將納米材料用于PCR體系中，提高了PCR的特異性，增加了產量；拓寬了PCR的退火溫度范圍，使PCR在低至25 ℃時也能退火；有利于小片段DNA的擴增；可以代替緩沖液中Mg2＋的作用。

預計今后的相關研究將會側重于以下幾個方面：（1） 尋找有利于大片段DNA擴增的納米材料。目前研究發現納米金對PCR的促進作用是更有利于小片段DNA（1 kb以下）的擴增。而在實際應用中，大片段DNA的擴增非常重要?，F在基因克隆研究中，長片段以及超長片段DNA（10 kb以上）的擴增還不能取得滿意的效果，主要原因是酶在PCR較高的變性溫度下（94 ℃）長時間的工作，會出現活性降低甚至失活，因此研究納米材料對PCR變性溫度的影響具有重要意義。通過納米材料來降低PCR的變性溫度或者增強聚合酶的耐高溫性質來實現長片段擴增的理想效果，是今后的一個研究方向；（2） 尋找新的納米材料來實現聚合酶的可控定量供應。細胞內有一整套參與反應的分子數量的定量控制體系，尤其是各種生物酶。而在PCR中，模板呈指數增長，對各反應組分尤其是聚合酶的需求也在變化，聚合酶不足會降低DNA的合成量，過量又易引發非特異擴增。通過納米材料來調控PCR過程中聚合酶的量，將有望解決現在PCR技術中存在的若干問題；（3） 使用人工納米材料將聚合酶和PCR的其它各反應成分連接起來，使其充分接觸反應，從而提高PCR反應效率；（4）根據PCR體系各種抑制劑的作用機制的不同，引入表面修飾有各種官能團的人工納米材料，與各種抑制劑反應，消除其對PCR體系的負面影響。

3 總結與展望

將納米材料引入到聚合酶鏈反應中，可以同時發揮納米材料和DNA的優點，極大地拓寬PCR技術的應用范圍。將納米材料用于PCR體系中，提高了PCR的特異性，增加了產量；拓寬了PCR的退火溫度范圍，使PCR在低至25 ℃時也能退火；有利于小片段DNA的擴增；可以代替緩沖液中Mg2＋的作用。

預計今后的相關研究將會側重于以下幾個方面：（1） 尋找有利于大片段DNA擴增的納米材料。目前研究發現納米金對PCR的促進作用是更有利于小片段DNA（1 kb以下）的擴增。而在實際應用中，大片段DNA的擴增非常重要?，F在基因克隆研究中，長片段以及超長片段DNA（10 kb以上）的擴增還不能取得滿意的效果，主要原因是酶在PCR較高的變性溫度下（94 ℃）長時間的工作，會出現活性降低甚至失活，因此研究納米材料對PCR變性溫度的影響具有重要意義。通過納米材料來降低PCR的變性溫度或者增強聚合酶的耐高溫性質來實現長片段擴增的理想效果，是今后的一個研究方向；（2） 尋找新的納米材料來實現聚合酶的可控定量供應。細胞內有一整套參與反應的分子數量的定量控制體系，尤其是各種生物酶。而在PCR中，模板呈指數增長，對各反應組分尤其是聚合酶的需求也在變化，聚合酶不足會降低DNA的合成量，過量又易引發非特異擴增。通過納米材料來調控PCR過程中聚合酶的量，將有望解決現在PCR技術中存在的若干問題；（3） 使用人工納米材料將聚合酶和PCR的其它各反應成分連接起來，使其充分接觸反應，從而提高PCR反應效率；（4）根據PCR體系各種抑制劑的作用機制的不同，引入表面修飾有各種官能團的人工納米材料，與各種抑制劑反應，消除其對PCR體系的負面影響。