作者：李辰 劉鶴松 孟慶繁 郭偉良 滕樂生 滕利榮

【摘要】 目的建立了一種無損的、可在線快速測定斯普林注射液中核糖和多肽含量的新方法。方法采用光譜儀掃描不同批次的斯普林注射液樣品的紫外光譜，然后采用經典的分析方法測定對應樣品中核糖和多肽的含量，應用徑向基神經網絡（RBFNN）建立了斯普林注射液樣品的紫外光譜與其中核糖和多肽含量間的定量關系模型。通過選擇最有效的光譜預處理方法、網絡的最優拓撲結構參數和最佳擴展常數對模型進行最優化。結果應用最優模型對斯普林注射液預測集樣品中核糖和多肽含量，預測均方根誤差（RMSEP）分別為0.013 2和0.013 8。結論 紫外光譜方法測定斯普林注射液中核糖和多肽含量，預測精度高，方法簡便可行，且多組分可同時測定，為測定中藥組分含量提供了一條新途徑。

【關鍵詞】 紫外光譜 徑向基神經網絡 斯普林注射液

斯普林注射液（小牛脾提取物注射液）是用于提高機體免疫力的藥物。從健康小牛健康脾臟中提取的高活性的分子多肽物能刺激骨髓肝細胞增殖，升高外周血白細胞，促進造血功能的恢復，有效地緩解化療藥物所導致的血細胞減少、出血等副作用，而且能激活機體免疫系統，明顯地減輕患者疼痛，有效緩解化療所導致的惡心、嘔吐，恢復患者體力，改善睡眠，穩定情緒，增加食欲，提高患者生活質量［1］。李霞等［2］對貴州少數民族地區的住院治療的88例晚期腫瘤病人進行了斯普林與參麥注射液對照治療觀察，結果顯示斯普林對晚期癌癥病人全身狀況改善方面有較好的輔助治療。斯普林注射液主要有效成分為核糖和多肽，而這些主成分常規分析方法主要為Folin酚法、高效液相色譜法［3］、凱氏定氮法［4］，分光光度法［5］等，這些方法均需要對樣品進行預處理，需要很多有機試劑，操作繁瑣，本文采用紫外光譜結合徑向基神經網絡［6］（RBFNN）建立快速無損定量分析斯普林注射液中核糖和多肽含量的新方法。

1 器材

1.1 儀器 紫外可見近紅外分光光度計（UV-3150，日本島津公司）。

1.2 試劑與材料 斯普林注射液（吉林馬應龍制藥有限公司，中國）；D-核糖；三氯醋酸；牛血清白蛋白。

2 方法與結果

2.1 紫外光譜的采集 采用紫外可見近紅外分光光度計對不同批次的斯普林注射液40個樣品進行紫外光譜掃描，光譜波長范圍設為200～400 nm，光譜通帶寬度設置為2 nm，每個樣品掃描3次，取平均光譜作為該樣品的光譜。斯普林注射液紫外光譜如圖 1，本文采用RBFNN建立斯普林注射液樣品紫外光譜與其中的核糖和多肽含量間的定量分析模型，應用所建立的模型可同時測定斯普林注射液樣品中核糖和多肽的含量，該方法具有簡單、快捷、無污染和無預處理等優點。

圖1 斯普林注射液樣品紫外光譜

2.2 核糖含量的測定 精密稱取D-核糖適量，用5%三氯醋酸溶液溶解制成20 μg/ml的標準溶液。分別精密移取0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 ml的標準溶液于具塞試管中，用5%三氯醋酸溶液定容至2 ml各加入3，5-二羥基甲苯溶液2.0 ml，搖勻，水浴中準確加熱30 min，迅速冷卻，于650 nm波長處測定吸光度，標準曲線回歸方程為Y=22.080X-0.008，R2＝0.997。精密移取2 ml供試品液，按照標準曲線制備的方法測定不同批次斯普林注射液樣品中核糖含量。表1 各樣品集中核糖和多肽含量的統計

2.3 多肽含量的測定 采用Folin酚法測定斯普林注射液中多肽含量，以牛血清白蛋白為標準品繪制標準曲線，曲線回歸方程為Y=1.369 9X-0.013 3，R2＝0.996，線性范圍為0.025～0.250 mg/ml。

斯普林注射液樣品中核糖和多肽含量統計見表1。

2.4 徑向基神經網絡定量分析模型的建立采用卷積平滑、一階導數、二階導數和標準正態變量轉換（SNV）分別對所有斯普林注射液樣品的紫外光譜進行預處理，然后采用主成分析方法對原始光譜和預處理后光譜矩陣進行主成分分析（PCA），根據第一主成分與第二主成分得分作圖，將樣品分為校正集、預測集和驗證集樣品，以主成分得分作為RBFNN網絡的輸入節點，以“2.2”項和“2.3”項所測得的核糖和多肽含量為輸出節點，建立測定斯普林注射液中核糖和多肽含量的定量分析模型，為了避免模型出現過擬和，本實驗引進逼近度（Da）為模型優化參數，對模型輸入節點數、隱含節點數和擴展常數進行優化，逼近度（Da）的計算方法如式（1）和（2）：

ea=［ncn］ec+［nvn］ev+│ec-ev│ （1）

Da=cea（2）

式中ea，ec，ev分別是逼近誤差、校正集均方根誤差（RMSEC）和驗證均方根誤差（RMSEV），n， nc， nv，分別為樣品總數、校正集樣品數和驗證集樣品數。C是常數(本文中C取0.000 1)，主要以調整Da大小方便于作圖，模型的預測能力以預測均方根誤差（RMSEP）來評價，RMSEC，RMSEV和RMSEP的算法可

2.5 徑向基神經網絡模型的優化

2.5.1 光譜預處理方法的選擇 分別采用一階導數、二階導數、卷積平滑光譜和SNV光譜預處理方法對斯普林注射液樣品的原光譜進行預處理，然后應用PCA的方法對原始光譜和各預處理后的光譜進行主成分提取，以主成分得分作為輸入節點建立測定斯普林注射液樣品中核糖和多肽含量的定量分析模型，各光譜所建立的最優模型的性能參數列于（表2），由表 2而可以看出，在測定核糖含量時，采用一階導數光譜所建立的模型的RMSEC，RMSEP和RMSEV最小，同時它具有最大的Da值，而在測定多肽含量時，采用SNV光譜所建立的模型的RMSEC，RMSEP和RMSEV最小，Da值也為最大值，因此確定測定核糖和多肽含量時，最有效的光譜預處理方法分別為一階導數光譜法和SNV方法。表2 原始光譜及不同預處理后光譜所建立的測定核糖和多肽含量最優模型的性能參數

2.5.2 光譜輸入節點數的選擇 采用PCA方法對光譜進行分析，提取光譜前20主成分，分別以前3～20主成分的得分作為RBFNN的輸入節點，為了避免模型出現過擬合的現象，以逼近度（Da）為評價標準，考察輸入節點數對模型性能的影響見圖2，由圖 2可以看出，在測定核糖合多肽含量時候，最佳的輸入節點數分別為10和13。

圖2 輸入節點數對測定斯普林注射液中核糖與多肽

含量的定量分析模型的RMSEC，RMSEV和Da的影響

2.5.3 隱含節點數的選擇 RBFNN是從0個神經元開始訓練，通過檢查輸出誤差使網絡自動增加神經元，直到誤差達到要求或是最大隱含層神經元數為止。隱含節點太少，擬合不充分；隱含節點增加得過多會過擬合。所以本文以Da為模型優化的標準，選出最合適的隱含層節點數。圖 3是在最不同隱含節點數對Da的影響，由圖 3可以看出測定核糖和多肽模型的最佳隱含節點數均為19。

圖3 隱含節點數對測定斯普林注射液中核糖

與多肽含量的定量分析模型的RMSEC，RMSEV和Da的影響

2.5.4 擴展常數的選擇 擴展常數的大小關系到擬合函數變化的快慢，從而影響模型的擬合程度，以Da為標準，考察擴展常數在0.3～9范圍內對模型的影響，以選擇合適的擴展常數，結果如圖 4所示，由圖 4可以看出，在測定斯普林注射液樣品中的核糖和多肽含量時模型最適的擴展常數分別為0.6和1.2。

2.6 最優模型的建立 采用RBFNN結合紫外光譜建立測定斯普林注射液樣品中核糖和多肽含量的定量分析模型，模型經過選擇最有效的光譜預處理方法、最適的輸入節點數、隱含節點數和擴展常數，得到最優的模型，應用最優的模型預測各樣品集的核糖和多肽含量，預測值與化學測量值間的相關性如圖 5，由圖 5可以看出預測值與化學測量值吻合的很好，說明該方法可行。

2.7 最優模型對預測集樣品的預測 采用“2.6”項中所建立的最優模型對預測集樣品中的核糖和多肽含量進行預測，預測均方根誤差（RMSEP）分別為0.013 2和0.013 8，預測值和真實值列于表 3，計算預測值與真實值間的絕對誤差和樣品回收率，由表 3可以看出，核糖含量的預測值與真實值間絕對誤差不大于0.023，平均回收率為101.224%，而多肽預測值間的絕對誤差不大于0.033，平均回收率為101.651%，說明預測值與真實值吻合的比較好，模型預測能滿足要求。表3 最優模型對預測集樣品中核糖和多肽含量預測值與真實值統計結果

3 討論

本實驗應用徑向基神經網絡結合紫外光譜建立了測定斯普林注射液中核糖和多肽含量的定量分析模型，文中引進逼近度作為模型優化的參數，可有效地避免模型發生過擬合現象。模型經過優化后，對預測集樣品中的多肽和核糖含量進行預測，預測均方根誤差（RMSEP）達到0.0132和0.0138，說明模型具有很高的預測精度，可應用于斯普林注射液質量監測。

本實驗方便快捷，不需有機試劑，無污染，操作簡單，并可兩組分同時檢測，質量準確，可應用于斯普林注射液生產的質量檢測和在線監控。

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