作者：劉霞 包翠芬 張曉明 穆長(zhǎng)征

【摘要】 目的： 對(duì)生后小鼠腎臟發(fā)生發(fā)育不同階段中神經(jīng)型一氧化氮合酶（nNOS)的表達(dá)進(jìn)行定量分析，探討nNOS在小鼠生后腎臟發(fā)育中的意義。方法： 分別取新生（出生小于2h）、生后3、5、7、14、40天昆明小鼠各8只，共6組，用免疫印跡技術(shù)和光密度分析方法對(duì)各組小鼠生后腎神經(jīng)型一氧化氮合酶進(jìn)行定量檢測(cè)，以測(cè)得的一氧化氮合酶最大量為 1( 100% ) ，計(jì)算蛋白相對(duì)含量， SPSS10. 0統(tǒng)計(jì)軟件包統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果： 新生組酶含量最高為100%， 隨年齡增長(zhǎng)酶含量逐漸減少，至成年達(dá)到最低水平為44.8±2.4% 。 結(jié)論： 這一趨勢(shì)表明nNOS可能在小鼠生后腎臟發(fā)育的早期階段起重要調(diào)節(jié)作用。

【關(guān)鍵詞】 小鼠 ; 腎 ; 神經(jīng)型一氧化氮合酶

一氧化氮（NO）作為體內(nèi)重要的信使分子和效應(yīng)分子，在調(diào)節(jié)腎臟血流動(dòng)力學(xué)方面具有重要的作用。腎臟中的NO主要由一氧化氮合酶（NOS）催化產(chǎn)生。NOS有三個(gè)亞型，即神經(jīng)型一氧化氮合酶(nNOS)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)［1］。目前對(duì)腎發(fā)生發(fā)育過(guò)程中NO和 NOS的研究還剛剛起步 ，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)定量方法檢測(cè)生后小鼠的發(fā)生發(fā)育不同階段nNOS的含量，旨在探討nNOS在小鼠腎臟發(fā)生發(fā)育中的意義。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 成年健康昆明小鼠（遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。根據(jù)小鼠孕程確認(rèn)仔鼠出生時(shí)間 ，取新生（小于2h）、3、5、7、14、40天小鼠各8只，共6組。

1.2 主要試劑 nNOS兔抗鼠多克隆抗體（北京中杉公司）；細(xì)胞裂解液、丙稀酰胺、N，N亞甲基雙丙稀酰胺、甘氨酸、Tween20、TritonX100、Trisbase、SDS和PVDF膜（SIGMA公司）。

1.3 Western blot步驟 各組小鼠麻醉后剖腹取右腎，PBS沖洗，迅速置于液氮冷凍，-70℃冰箱保存。取冷凍腎組織，加入3倍體積的細(xì)胞裂解液，0℃下剪碎、勻漿，將組織勻漿液靜置30min，4℃，12000rpm 離心10min，留取上清液。用Bradford法測(cè)定蛋白含量，分裝成每離心管中含10μg蛋白，-20℃冰箱保存。 配制10%分離膠和5%濃縮膠，取10μg(30μl)腎組織蛋白細(xì)胞裂解上清液，加入10μl SDS樣品緩沖液，100℃加熱3min，離心。取上述裂解液加入電泳膠樣品槽，100V電壓下電泳，待樣品到達(dá)合適位置，停止電泳，將膠板取下，轉(zhuǎn)膜液洗滌10～30min。將膠與0.45μmPVDF膜(用前置于甲醇內(nèi)浸透5min左右，再放入轉(zhuǎn)膜液中至少5min)置于厚濾紙(已用轉(zhuǎn)膜液浸泡)之間，趕盡氣泡，常溫下半干轉(zhuǎn)印，轉(zhuǎn)印完成后將PVDF膜用TBST(TBS1%Tueen20溶液)沖洗，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1～2h。與一抗(兔抗小鼠nNOS抗體，稀釋度為1∶400)4℃孵育過(guò)夜，TBST洗脫3次，每次至少5min； 再與二抗(堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體，稀釋度為1∶200)室溫孵育1h，TBST溶液洗脫3次， 每次至少5min；NBT/BCIP顯色；掃描電泳條帶，輸入電腦，用光密度分析軟件分析電泳條帶光密度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用 q檢驗(yàn)，以 P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果 生后小鼠腎臟發(fā)生發(fā)育不同階段 nNOS含量分析 Western blot電泳條帶圖顯示新生小鼠nNOS含量最高，隨著腎臟發(fā)生發(fā)育逐漸降低，到成年降低至最低水平。光密度分析顯示：以測(cè)得的nNOS最大量為1，計(jì)算各組nNOS表達(dá)相對(duì)含量（百分?jǐn)?shù)）。新生小鼠nNOS含量最高（100%），出生后3天降低，生后5天進(jìn)一步降低，到成年降至最低水平。見表 1。

表1 小鼠生后不同階段腎臟nNOS表達(dá)的光密度百分?jǐn)?shù)（略）

注：*與成年組比較，P<0.01；#與新生組比較，P<0.05。

3 討論 本實(shí)驗(yàn)表明生后小鼠發(fā)生發(fā)育不同階段中，新生小鼠腎臟的nNOS含量最高（P<0.05）。nNOS是一種結(jié)構(gòu)酶，其表達(dá)越多，則可能產(chǎn)生NO越多，作為新生小鼠體內(nèi)唯一的血管舒張因子，通過(guò)對(duì)抗高活性血管收縮因子特別是血管緊張素Ⅱ的作用，可增加腎血流量（RBF）及腎小球?yàn)V過(guò)率（GFR），調(diào)節(jié)腎臟正常的生理活動(dòng)［2］。生后小鼠早期階段高腎血管阻力（RVR）、低RBF、低GFR的生理特點(diǎn)是促使nNOS表達(dá)的主要因素，可見nNOS在腎臟功能發(fā)育的早期對(duì)腎血液動(dòng)力學(xué)的調(diào)節(jié)起著重要作用。此外nNOS的表達(dá)還與細(xì)胞自身的生長(zhǎng)發(fā)育與增殖、母體較高的雌激素水平相關(guān)，另外生長(zhǎng)因子、低氧也能上調(diào)nNOS的表達(dá)［3，4］。 在生后小鼠腎臟發(fā)生發(fā)育中，隨著腎單位的形成、集合管的分化，腎功能也進(jìn)一步完善，體現(xiàn)在RBF與GFR增加、腎小管重吸收功能完善等諸多方面。有研究表明： NOS抑制劑可以減少25%左右的腎血流量［5］。可見源于nNOS的NO對(duì)血流動(dòng)力學(xué)的調(diào)節(jié)起著關(guān)鍵性作用，仍是維持腎血管低張力的必要物質(zhì)和重要調(diào)節(jié)劑。但是隨著腎臟本身結(jié)構(gòu)與功能日趨完善，NO的調(diào)節(jié)作用較生后小鼠腎臟發(fā)育早期有所降低，表現(xiàn)為nNOS表達(dá)含量的降低。在生后小鼠腎臟發(fā)育后期，NO主要通過(guò)球旁反饋機(jī)制調(diào)節(jié)腎臟功能。生理學(xué)認(rèn)為動(dòng)物在成熟過(guò)程中許多器官和組織都能產(chǎn)生腎素，有局部的腎素血管緊張素系統(tǒng)存在，而在成年小鼠腎臟中，血管緊張素Ⅱ可以通過(guò)腎素受體下調(diào)nNOS的含量而改變腎動(dòng)脈血管張力［6］。這可以解釋免疫印跡中生后小鼠腎臟中nNOS表達(dá)含量呈降低趨勢(shì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。另外，在生后腎發(fā)育過(guò)程中腎間質(zhì)增多，腎實(shí)質(zhì)比例減少，也使單位體積nNOS含量降低。總之在生后小鼠腎臟發(fā)育不同階段，nNOS表達(dá)呈動(dòng)態(tài)變化，這種變化不僅與其結(jié)構(gòu)與功能發(fā)育相適應(yīng)，而且還受自身所處環(huán)境影響。新生小鼠的腎臟nNOS表達(dá)含量最高，成年小鼠nNOS表達(dá)含量最低，這一趨勢(shì)表明nNOS可能在生后小鼠腎臟發(fā)育的早期階段起重要作用。