【摘要】 目的： 探討中西藥結合對人胃癌多藥耐藥細胞SGC7901/ADR的逆轉和誘導凋亡作用. 方法： 以斑貞1號和/或氟尿嘧啶（5FU）為陽性對照組，采用MTT法觀察斑貞1號與5FU，川芎嗪（TMP）聯(lián)合對SGC7901/ADR細胞的逆轉及殺傷作用. 采用流式細胞儀（FCM）測定各藥物組細胞周期的變化. 光鏡和電鏡觀察藥物聯(lián)合前后SGC7901/ADR細胞形態(tài)結構變化. 結果： TMP明顯提高SGC7901/ADR細胞對斑貞1號+5FU的敏感性，逆轉倍數(shù)為10.39倍. 細胞毒作用為:斑貞1號+5FU+TMP>斑貞1號+5FU>斑貞1號>5FU（P<0.01）. FCM分析證明3種藥物聯(lián)合與對照組相比可將細胞阻滯在DNA合成前期和靜息期G0/G1期（P<0.05）. 光鏡和電鏡下觀察到癌細胞體積變小，胞體全面變圓皺縮及典型的凋亡形態(tài)學改變. 結論： 中西藥結合對SGC7901/ADR細胞有較強的逆轉和誘導凋亡作用，為當前腫瘤治療提供了新思路.

【關鍵詞】 西醫(yī)結合">中西醫(yī)結合療法 胃腫瘤 腫瘤細胞 多藥耐藥性 逆轉 調亡

0引言

化療在胃癌綜合治療中發(fā)揮著重要作用，但療效差，主要是細胞對化療藥物產生了多藥耐藥性（multidrug resistance，MDR）［1-2］. 解決MDR主要方法，一是尋找對MDR細胞有效的抗腫瘤藥物，二是通過增加細胞內藥物濃度而逆轉MDR. 但多數(shù)逆轉劑的毒副作用限制了它們的臨床應用. 中西醫(yī)結合治療腫瘤較中醫(yī)或西醫(yī)單獨應用療效佳，但對多藥耐藥腫瘤細胞是否有逆轉作用，報道甚少. 我們觀察中西藥結合（斑貞1號+5FU+TMP）對SGC7901/ADR細胞MDR的逆轉及誘導凋亡作用.

1材料和方法

1.1材料人胃癌多藥耐藥細胞株SGC7901/ADR細胞由第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院消化研究所惠贈. TMP注射液，北京永康藥業(yè)有限公司產品. 5FU注射液，南通精華制藥有限公司產品. 阿霉素（ADM）注射液，汕頭經濟特區(qū)明治醫(yī)藥有限公司產品. 斑貞1號合劑（斑蝥0.06 g，露蜂房12 g，山茱萸，女貞子各15 g），內蒙古包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院中醫(yī)科制備，含原藥200 g/L. RPMI1640，美國Gibco公司產品. MTT，DMSO，胰蛋白酶，美國Sigma公司產品. 新生小牛血清，杭州四季青生物研究所產品. 流式細胞儀試劑盒，Exalpa公司產品. 倒置顯微鏡，重慶光學儀器廠產品. 酶標儀，美國Biotek公司產品. 流式細胞儀，美國BD公司產品. Hitachi750透射電鏡，日本日立公司產品.

1.2方法將SGC7901/ADR細胞置于含1.0 mg/L ADM，100 mL/L新生小牛血清，100 kU/L青霉素，100 mg/L 鏈霉素的RPMI1640細胞培養(yǎng)液中，37℃，50 mL/L CO2飽和濕度孵箱內培養(yǎng). 實驗兩周前培養(yǎng)于不含ADM的細胞培養(yǎng)液中. 取對數(shù)生長期的SGC7901/ADR細胞，以5×107/L接種于96孔板上，培養(yǎng)24 h，實驗孔按下列分組加入藥物：(1)空白對照組，(2)陰性對照組，(3)5FU組（10～105μg/L），(4)斑貞1號組（10～105μg/L），(5)斑貞1號（10～105μg/L）＋5FU（10～105μg/L）組，(6)斑貞1號（10～105μg/L）＋5FU（10～105μg/L）＋TMP(終濃度300 mg/L)（參照臨床用量的血峰濃度設定實驗藥物濃度）. 各濃度設5個平行孔，培養(yǎng)48 h，加入5 g/L MTT 20 μL，作用4 h后加入DMSO150 μL，搖床搖勻，以酶聯(lián)免疫儀490 nm波長測定各孔吸光度A值［3］. 光鏡下動態(tài)觀察并拍照. 計算不同濃度下細胞的存活率SR［4］［SR=(實驗組A值/對照組A值)×100%］、半數(shù)抑制濃度IC50及逆轉倍數(shù)RI(RI=單獨用藥IC50/聯(lián)合逆轉劑后IC50).

1.2.1細胞周期的分析收集經過不同濃度藥物處理的SGC7901/ADR細胞，PBS洗滌后，700 mL/L冷乙醇固定過夜，離心去乙醇，加入10 mg/L RNA酶溶液及碘化丙啶（PI）染液，黑暗避光37℃水浴20 min，經特制的尼綸網(wǎng)濾器過濾（冰上操作）于檢測管內，上流式細胞儀檢測DNA含量和細胞周期，資料用Cellquest軟件進行分析.

1.2.2細胞形態(tài)變化將SGC7901/ADR細胞以5×107/L傳代4瓶，2瓶對照，2瓶用藥. 孵育24 h后，用藥組加入斑貞1號（終濃度0.5 mg/L）+5FU（終濃度0.5 mg/L）+TMP（終濃度300 mg/L）共4 mL，對照組更換培養(yǎng)液4 mL. 培養(yǎng)48 h后收集胰酶消化脫壁細胞，25 g/L戊二醛預固定，繼用20 g/L俄酸固定，經梯度酒精脫水后用EPON812包埋，制作超薄切片（600 A），染色按常規(guī)處理，經醋酸鈉和檸檬酸鋁雙染后，電鏡觀察超微結構并拍照.

統(tǒng)計學處理: 計量數(shù)據(jù)用x±s表示，采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件包進行單因素方差分析及LSDt檢驗，P<0.05為有統(tǒng)計學意義.

2結果

2.1SGC7901/ADR細胞的逆轉和細胞毒作用300 mg/L TMP與斑貞1號和5FU聯(lián)合可增強SGC7901/ADR細胞對斑貞1號+5FU的敏感性，逆轉倍數(shù)為10.39倍，使其殺瘤效果增強. 對細胞的細胞毒作用依次為:斑貞1號+5FU+TMP>斑貞1號+5FU>斑貞1號>5FU（P<0.01，表1）. 光鏡下可見中西醫(yī)結合組癌細胞體積變小，胞體全面變圓皺縮，細胞生長明顯受到抑制（圖1）.

表1中西藥聯(lián)合對SGC7901/ADR細胞的細胞毒作用（略） bP<0.01 vs 5FU組和斑貞1號+5FU組.

A: 陰性對照組; B: 斑貞1號+5Fu+TMP組.

圖1SGC7901/ADR細胞形態(tài)倒置顯微鏡 ×400（略）

2.2細胞周期分析中西藥結合組可使SGC7901/ADR細胞周期明顯阻滯在DNA合成前期和靜息期G0/G1期，進入S期細胞減少，抑制細胞DNA的合成和有絲分裂（P<0.05），誘導其凋亡（表2）.

2.3細胞超微結構的變化對照組癌細胞呈圓形或卵圓形，核大而不規(guī)則，核質比例大，核內異染色質較細，均勻分于核膜內側，核仁1~2個，清晰可見，細胞質較少(圖2A). 用藥組癌細胞發(fā)生皺縮，胞膜表面微絨毛和偽足消失. 核縮小，核質比例小，部分細胞呈現(xiàn)典型凋亡改變，核固縮成球形或新月形或呈波紋狀或折縫樣，核仁消失，胞質內質網(wǎng)擴張，線粒體腫脹，出現(xiàn)空炮變性，繼之細胞出泡，小泡脫落，大量凋亡小體形成(圖2B).

表2藥物對腫瘤細胞周期分布的影響（略）

A: 對照組×4000； B: 用藥組×5000.

圖2SGC7901/ADR細胞超微結構（略）

3討論

MDR是指腫瘤細胞接觸一種化療藥物并產生耐藥性，同時對其他結構和作用機制不同的化療藥物具交叉耐藥性［5］. 5FU是主要治療胃癌化療藥物之一，本課題組先前已證實了SGC7901/ADR細胞對5FU具有耐藥性，相對耐藥性為97.49. 同時在尋找高效低毒的逆轉劑研究中，也證實了TMP較維拉帕米（VP）有較強的逆轉作用. 然而腫瘤細胞的MDR是由多種因素、多種機制共同作用的結果，涉及到多種轉運蛋白的改變、解毒系統(tǒng)的激活、凋亡通路的改變、DNA修復系統(tǒng)的增強等，特別是多種轉運蛋白共同轉運一種抗癌藥形成的耐藥性是導致目前的逆轉只能部分逆轉腫瘤細胞耐藥性的重要原因. 許多研究表明［6］，中西藥有機結合使用，可互相取長補短，表現(xiàn)出明顯的協(xié)同作用. 因此，有計劃、合理地運用中西醫(yī)結合治療便成為逆轉MDR，誘導癌細胞凋亡，提高療效的重要措施.

傳統(tǒng)中醫(yī)認為胃癌病機要點為臟腑陰陽失調，痰濁瘀毒，積聚凝結，胃腑壅塞，屬本虛標實之證，治療多采用殺毒化瘤、補氣養(yǎng)血之法. 斑貞1號具有扶正祛邪，抑癌抗癌的作用. 本課題結果表明，TMP可以明顯提高SGC7901/ADR細胞對斑貞1號和5FU的敏感性，三種藥物聯(lián)合與對照組相比對SGC7901/ADR細胞有較強的逆轉和誘導細胞凋亡的作用，使胃癌耐藥細胞出現(xiàn)了典型的凋亡形態(tài)學改變，使細胞阻滯在G0/G1期. 其機制是否通過作用于腫瘤細胞胞質骨架微管和微絲結構，引起骨架異常，導致有絲分裂紊亂？或是影響多藥耐藥相關基因的表達及功能?調控凋亡相關基因表達誘導凋亡？這些問題值得進一步深入研究. 通過對斑貞1號聯(lián)合5FU及TMP對胃癌耐藥細胞的多藥耐藥性的作用和機制的研究，將會為胃癌多藥耐藥的治療提供可靠的依據(jù).

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