作者：高健群，巫全勝，錢寧，吳曙光

【摘要】 目的探討肅肺潤腸湯對藥物依賴性便秘大鼠大腸杯狀細胞、5-HT的變化。方法清潔級SD大鼠45只，隨機分為正常對照組(n=15)，大黃模型組(n=15) 和大黃模型治療組(n=15)以下分別簡稱對照組、模型組、治療組。除對照組外，模型及治療組先建立大鼠藥物依賴性便秘模型，在模型基礎上，治療組大鼠給予肅肺潤腸湯灌胃治療，再采用普通組織學、免疫組織化學SABC法和細胞計數進行研究在給中藥復方前后的大鼠大腸杯狀細胞、5-HT免疫反應細胞的形態分布及數量的變化。結果與模型組比較，治療組大腸杯狀細胞、5-HT細胞數量均增加，差異非常顯著(P<0.01)，且后者免疫染色強度增強。結論肅肺潤腸湯可以提高藥物依賴性便秘大鼠腸道杯狀細胞、免疫反應細胞5-HT的形態分布和數量，從而促進胃腸蠕動，改善胃腸道的傳輸功能。

【關鍵詞】 肅肺潤腸湯; 藥物依賴性便秘模型; 杯狀細胞; 5-HT

藥物依賴性便秘是指便秘之人長期服用瀉劑，引起瀉劑成癮，不服用瀉劑則不能排便，以致越瀉越秘[1]。當前對于不危及生命但又影響生活質量的本病，研究多不深入。本實驗所研究的肅肺潤腸湯[2]是治療藥物依賴性便秘的臨床經驗方，繼我們成功建立該動物模型后，又應用肅肺潤腸湯對藥物依賴性便秘大鼠的杯狀細胞、5-HT免疫反應細胞所發生的形態及數量變化進行了初步研究。現報道如下。

1 材料與儀器

1.1 動物實驗動物：大鼠，雌性，日齡45～55 d，由貴陽醫學院實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(黔)2002-0001。

1.2 儀器光學顯微鏡:日本Olympus公司生產。

1.3 藥物①生大黃，由貴陽市同濟大藥房提供，甘肅省產，生產批號05053001。生大黃溶液的配制;生大黃浸泡12 h，絞汁過濾后，裝入燒杯，放入40℃的恒溫水箱，濃縮至含生藥1 g/ml，4℃冰箱保存，使用前復溫。②肅肺潤腸湯的組成：阿膠10 g，蘇子15 g，杏仁10 g，枳殼10 g，沉香4 g，等，貴陽市同濟藥堂提供，將上述藥物按人和動物比例折算用量，配制及保存同生大黃。

1.4 試劑兔抗5-HT(工作濃度：1∶200，北京中杉金橋生物技術有限公司);羊抗兔IgG和SABC復合物(工作濃度：1∶100，武漢博士德生物工程公司)。

2 方法

2.1 造模方法

2.1.1 動物分組清潔級SD大鼠45只，體質量180～220 g，雌性，隨機分為對照組(n=15)，模型組(n=15)，治療組(n=15)，單籠飼養。室溫22～25℃，濕度<60﹪，噪音<50dB。

2.1.2 模型建立[3]大鼠適應性飼養3 d后稱重，造模組不禁食限水，致大鼠形成便秘[4]，1周后用大黃水溶液灌胃給予治療[5]，起始劑量均為20 mg∕(100 g·d); 按每天20 mg∕(100 g·d)遞增，至約半數以上動物出現稀便時，再維持此劑量不變直到稀便消失，使大鼠對藥物產生依賴，再逐漸停止限水;同時按20 mg/(100g·d)遞增，保持半數以上動物出現稀便現象飼養3個月，大黃最終用量320 mg/(100g·d)。正常對照組每天以蒸餾水1.5 ml/100g灌胃1次。各組連續灌胃6 d，停藥1 d。

2.1.3 取材及普通組織學標本制備成功建立大鼠藥物依賴性便秘模型并經治療后，頸椎脫臼法將大鼠處死，迅速取結腸近端(離盲腸約1 cm)及遠端(離肛門約2 cm)各一段約2 cm，生理鹽水沖洗，放置10﹪福爾馬林液體中固定，常規梯度酒精脫水，石蠟包埋，HE染色。

2.1.4 免疫組織化學SABC法按免疫組織化學SABC法進行免疫組織化學染色，顯示5-HT免疫反應細胞。主要步驟：切片常規脫蠟至水，室溫10%甲醇-H2O2 10 min，正常山羊血清(1∶50)室溫下封閉30 min，依次滴加兔抗血清4℃孵育過夜，羊抗兔IgG(1∶100)37℃下孵育20 min，SABC復合物(1∶100)37℃下孵育20 min，DAB- H2O2液顯色，蘇木精復染細胞核，中型樹膠封片。

2.1.5 細胞記數選取各組大鼠大腸切片，在200×物鏡下，每張切片隨機選取10個視野，分別記數每個視野內有核陽性5-HT-IR細胞數。

2.2 治療方法①模型組，只造模不灌服肅肺潤腸湯;②治療組，在造模完成后再灌服肅肺潤腸湯15 d;③對照組每天以蒸餾水1.5 ml∕100 g灌胃1次至實驗結束。

2.3 統計處理所得數據用±s表示，采用t檢驗，P<0.05表示差異顯著，P<0.01，表示差異非常顯著。

3 結果

3.1 一般情況在實驗過程中，實驗各組沒有動物死亡。對照組大鼠體胖、行動活躍、精神良好、皮毛潤澤、飲食不減，實驗后體重、食量隨增齡明顯高于實驗前。模型組大鼠形體消瘦，活動減少，皮毛色澤發黃無光澤且脫落嚴重，納差，精神萎靡，造模后體重明顯低于造模前，糞便排出量少、質硬，腸道的傳輸功能減慢。治療組一般情況較好，糞便排出量增多、質軟，腸道的傳輸功能減慢得到改善。

3.2 腸道普通組織學HE染色實驗各組腸道腸無特殊改變，但模型組腸道腸杯狀細胞數量(隨機選擇10個200×視野，取其平均值)比對照組減少，差異非常顯著(P<0.01);治療組杯狀細胞數量比模型組增多，差異非常顯著(P<0.01)，但比對照組也有顯著差異(P<0.05)。結果見表1。

3.3 大腸5-HT-IR細胞的光鏡免疫組織化學觀察光鏡下，對照組大腸5-HT-IR細胞經DAE-H2O2顯色，可見免疫反應產物呈棕黃色至棕黑色顆粒狀存在細胞質內。5-HT-IR細胞主要分布于腸絨毛上皮細胞以及腸腺上皮之間。與對照組比較，模型組5-HT-IR細胞形態分布由黏膜轉到黏膜下層，且免疫染色減弱，反應產物呈淡黃色，尤其是細胞數量減少，差異非常顯著(P<0.01);治療組比對照組也有顯著差異(P<0.05)。結果見表1及圖1～3。

3.4 大腸杯狀細胞、5-HT-IR細胞計數的結果各組大鼠大腸杯狀細胞計數5-HT-IR細胞計數的比較如表1所示模型組較正常對照組大腸杯狀細胞數及5-HT-IR細胞數/10視野減少(隨機選擇10個20×視野，取其平均值)P<0.01，治療組則較同期模型組增多(P<0.01)，差異極顯著有統計學意義。表1 各組大鼠大腸杯狀細胞、5-HT-IR細胞計數/視野(±s)

4 討論

杯狀細胞是腸道的正常細胞，有分泌粘液，潤滑和保護腸道粘膜的作用[6]。5-HT主要來源于胃腸道的肥大細胞、EC細胞、部分胃腸道肌間神經叢神經元及黏膜下神經叢的神經節纖維，其不僅是重要的腸道神經遞質，也是重要的免疫調節因子 ，它可通過多種受體直接作用于多種免疫細胞，是神經 - 內分泌 - 免疫調節網絡中的重要成分[7]。研究發現，藥物依賴性便秘大鼠杯狀細胞、5-HT免疫反應細胞的減少，可能是造成該病的主要因素之一 [8]。圖1 對照組 圖2 模型組 圖3 治療組大腸5-羥色胺 大腸5-羥色胺 大腸5-羥色胺(5-HT，200×) (5-HT，200×) (5-HT，200×)

通過本實驗的觀察，我們發現，治療組較模型組大腸的杯狀細胞增多(P<0.01)，差異非常顯著，由于杯狀細胞增多，可能其分泌粘液的功能得到提高，腸道的潤滑程度也就加強了，從而可能促進了腸道傳輸功能;治療組較模型組大腸5-HT-IR細胞也明顯增多(P<0.01)，差異也非常顯著，免疫染色強度增強，分布也由黏膜下層轉到黏膜層。這些提示，大腸5-HT的分泌與合成均提高了。由于大腸5-HT興奮性神經遞質的增高，平滑肌收縮加強，腸蠕動加快，結腸推動運動增強，于是可能出現了腸道傳輸性功能加快的發生;另外，由于5-HT也是重要的免疫調節因子，5-HT免疫反應細胞增加也可能提高了機體免疫功能，原結腸有效的推動性運動減弱得到改善;雖然治療組較模型組杯狀細胞增多，但與對照組相比，大腸的杯狀細胞數量還是減少，(P<0.05)，差異顯著。說明治療組大腸的杯狀細胞并沒有恢復到正常水平，這是否與藥物的劑量、給藥時間的不足以及人與動物的體質差異有關，其機制還有待進一步研究。

總之，引起藥物依賴性便秘的因素是復雜的、多方面的，通過從本實驗的研究觀察，肅肺潤腸湯可以改善藥物依賴性便秘大鼠腸道杯狀細胞、免疫反應細胞5-HT的形態分布和數量從而促進胃腸蠕動，改善胃腸道的傳輸功能，充分說明中醫藥治療該病有潛在的前景。