作者：高健群，巫全勝，錢寧，吳曙光

【摘要】 目的探討肅肺潤腸湯對藥物依賴性便秘大鼠大腸杯狀細(xì)胞、5-HT的變化。方法清潔級SD大鼠45只，隨機分為正常對照組(n=15)，大黃模型組(n=15) 和大黃模型治療組(n=15)以下分別簡稱對照組、模型組、治療組。除對照組外，模型及治療組先建立大鼠藥物依賴性便秘模型，在模型基礎(chǔ)上，治療組大鼠給予肅肺潤腸湯灌胃治療，再采用普通組織學(xué)、免疫組織化學(xué)SABC法和細(xì)胞計數(shù)進(jìn)行研究在給中藥復(fù)方前后的大鼠大腸杯狀細(xì)胞、5-HT免疫反應(yīng)細(xì)胞的形態(tài)分布及數(shù)量的變化。結(jié)果與模型組比較，治療組大腸杯狀細(xì)胞、5-HT細(xì)胞數(shù)量均增加，差異非常顯著(P<0.01)，且后者免疫染色強度增強。結(jié)論肅肺潤腸湯可以提高藥物依賴性便秘大鼠腸道杯狀細(xì)胞、免疫反應(yīng)細(xì)胞5-HT的形態(tài)分布和數(shù)量，從而促進(jìn)胃腸蠕動，改善胃腸道的傳輸功能。

【關(guān)鍵詞】 肅肺潤腸湯; 藥物依賴性便秘模型; 杯狀細(xì)胞; 5-HT

藥物依賴性便秘是指便秘之人長期服用瀉劑，引起瀉劑成癮，不服用瀉劑則不能排便，以致越瀉越秘[1]。當(dāng)前對于不危及生命但又影響生活質(zhì)量的本病，研究多不深入。本實驗所研究的肅肺潤腸湯[2]是治療藥物依賴性便秘的臨床經(jīng)驗方，繼我們成功建立該動物模型后，又應(yīng)用肅肺潤腸湯對藥物依賴性便秘大鼠的杯狀細(xì)胞、5-HT免疫反應(yīng)細(xì)胞所發(fā)生的形態(tài)及數(shù)量變化進(jìn)行了初步研究。現(xiàn)報道如下。

1 材料與儀器

1.1 動物實驗動物：大鼠，雌性，日齡45～55 d，由貴陽醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(黔)2002-0001。

1.2 儀器光學(xué)顯微鏡:日本Olympus公司生產(chǎn)。

1.3 藥物①生大黃，由貴陽市同濟大藥房提供，甘肅省產(chǎn)，生產(chǎn)批號05053001。生大黃溶液的配制;生大黃浸泡12 h，絞汁過濾后，裝入燒杯，放入40℃的恒溫水箱，濃縮至含生藥1 g/ml，4℃冰箱保存，使用前復(fù)溫。②肅肺潤腸湯的組成：阿膠10 g，蘇子15 g，杏仁10 g，枳殼10 g，沉香4 g，等，貴陽市同濟藥堂提供，將上述藥物按人和動物比例折算用量，配制及保存同生大黃。

1.4 試劑兔抗5-HT(工作濃度：1∶200，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);羊抗兔IgG和SABC復(fù)合物(工作濃度：1∶100，武漢博士德生物工程公司)。

2 方法

2.1 造模方法

2.1.1 動物分組清潔級SD大鼠45只，體質(zhì)量180～220 g，雌性，隨機分為對照組(n=15)，模型組(n=15)，治療組(n=15)，單籠飼養(yǎng)。室溫22～25℃，濕度<60﹪，噪音<50dB。

2.1.2 模型建立[3]大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后稱重，造模組不禁食限水，致大鼠形成便秘[4]，1周后用大黃水溶液灌胃給予治療[5]，起始劑量均為20 mg∕(100 g·d); 按每天20 mg∕(100 g·d)遞增，至約半數(shù)以上動物出現(xiàn)稀便時，再維持此劑量不變直到稀便消失，使大鼠對藥物產(chǎn)生依賴，再逐漸停止限水;同時按20 mg/(100g·d)遞增，保持半數(shù)以上動物出現(xiàn)稀便現(xiàn)象飼養(yǎng)3個月，大黃最終用量320 mg/(100g·d)。正常對照組每天以蒸餾水1.5 ml/100g灌胃1次。各組連續(xù)灌胃6 d，停藥1 d。

2.1.3 取材及普通組織學(xué)標(biāo)本制備成功建立大鼠藥物依賴性便秘模型并經(jīng)治療后，頸椎脫臼法將大鼠處死，迅速取結(jié)腸近端(離盲腸約1 cm)及遠(yuǎn)端(離肛門約2 cm)各一段約2 cm，生理鹽水沖洗，放置10﹪福爾馬林液體中固定，常規(guī)梯度酒精脫水，石蠟包埋，HE染色。

2.1.4 免疫組織化學(xué)SABC法按免疫組織化學(xué)SABC法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，顯示5-HT免疫反應(yīng)細(xì)胞。主要步驟：切片常規(guī)脫蠟至水，室溫10%甲醇-H2O2 10 min，正常山羊血清(1∶50)室溫下封閉30 min，依次滴加兔抗血清4℃孵育過夜，羊抗兔IgG(1∶100)37℃下孵育20 min，SABC復(fù)合物(1∶100)37℃下孵育20 min，DAB- H2O2液顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，中型樹膠封片。

2.1.5 細(xì)胞記數(shù)選取各組大鼠大腸切片，在200×物鏡下，每張切片隨機選取10個視野，分別記數(shù)每個視野內(nèi)有核陽性5-HT-IR細(xì)胞數(shù)。

2.2 治療方法①模型組，只造模不灌服肅肺潤腸湯;②治療組，在造模完成后再灌服肅肺潤腸湯15 d;③對照組每天以蒸餾水1.5 ml∕100 g灌胃1次至實驗結(jié)束。

2.3 統(tǒng)計處理所得數(shù)據(jù)用±s表示，采用t檢驗，P<0.05表示差異顯著，P<0.01，表示差異非常顯著。

3 結(jié)果

3.1 一般情況在實驗過程中，實驗各組沒有動物死亡。對照組大鼠體胖、行動活躍、精神良好、皮毛潤澤、飲食不減，實驗后體重、食量隨增齡明顯高于實驗前。模型組大鼠形體消瘦，活動減少，皮毛色澤發(fā)黃無光澤且脫落嚴(yán)重，納差，精神萎靡，造模后體重明顯低于造模前，糞便排出量少、質(zhì)硬，腸道的傳輸功能減慢。治療組一般情況較好，糞便排出量增多、質(zhì)軟，腸道的傳輸功能減慢得到改善。

3.2 腸道普通組織學(xué)HE染色實驗各組腸道腸無特殊改變，但模型組腸道腸杯狀細(xì)胞數(shù)量(隨機選擇10個200×視野，取其平均值)比對照組減少，差異非常顯著(P<0.01);治療組杯狀細(xì)胞數(shù)量比模型組增多，差異非常顯著(P<0.01)，但比對照組也有顯著差異(P<0.05)。結(jié)果見表1。

3.3 大腸5-HT-IR細(xì)胞的光鏡免疫組織化學(xué)觀察光鏡下，對照組大腸5-HT-IR細(xì)胞經(jīng)DAE-H2O2顯色，可見免疫反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色至棕黑色顆粒狀存在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。5-HT-IR細(xì)胞主要分布于腸絨毛上皮細(xì)胞以及腸腺上皮之間。與對照組比較，模型組5-HT-IR細(xì)胞形態(tài)分布由黏膜轉(zhuǎn)到黏膜下層，且免疫染色減弱，反應(yīng)產(chǎn)物呈淡黃色，尤其是細(xì)胞數(shù)量減少，差異非常顯著(P<0.01);治療組比對照組也有顯著差異(P<0.05)。結(jié)果見表1及圖1～3。

3.4 大腸杯狀細(xì)胞、5-HT-IR細(xì)胞計數(shù)的結(jié)果各組大鼠大腸杯狀細(xì)胞計數(shù)5-HT-IR細(xì)胞計數(shù)的比較如表1所示模型組較正常對照組大腸杯狀細(xì)胞數(shù)及5-HT-IR細(xì)胞數(shù)/10視野減少(隨機選擇10個20×視野，取其平均值)P<0.01，治療組則較同期模型組增多(P<0.01)，差異極顯著有統(tǒng)計學(xué)意義。表1 各組大鼠大腸杯狀細(xì)胞、5-HT-IR細(xì)胞計數(shù)/視野(±s)

4 討論

杯狀細(xì)胞是腸道的正常細(xì)胞，有分泌粘液，潤滑和保護(hù)腸道粘膜的作用[6]。5-HT主要來源于胃腸道的肥大細(xì)胞、EC細(xì)胞、部分胃腸道肌間神經(jīng)叢神經(jīng)元及黏膜下神經(jīng)叢的神經(jīng)節(jié)纖維，其不僅是重要的腸道神經(jīng)遞質(zhì)，也是重要的免疫調(diào)節(jié)因子 ，它可通過多種受體直接作用于多種免疫細(xì)胞，是神經(jīng) - 內(nèi)分泌 - 免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中的重要成分[7]。研究發(fā)現(xiàn)，藥物依賴性便秘大鼠杯狀細(xì)胞、5-HT免疫反應(yīng)細(xì)胞的減少，可能是造成該病的主要因素之一 [8]。圖1 對照組 圖2 模型組 圖3 治療組大腸5-羥色胺 大腸5-羥色胺 大腸5-羥色胺(5-HT，200×) (5-HT，200×) (5-HT，200×)

通過本實驗的觀察，我們發(fā)現(xiàn)，治療組較模型組大腸的杯狀細(xì)胞增多(P<0.01)，差異非常顯著，由于杯狀細(xì)胞增多，可能其分泌粘液的功能得到提高，腸道的潤滑程度也就加強了，從而可能促進(jìn)了腸道傳輸功能;治療組較模型組大腸5-HT-IR細(xì)胞也明顯增多(P<0.01)，差異也非常顯著，免疫染色強度增強，分布也由黏膜下層轉(zhuǎn)到黏膜層。這些提示，大腸5-HT的分泌與合成均提高了。由于大腸5-HT興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的增高，平滑肌收縮加強，腸蠕動加快，結(jié)腸推動運動增強，于是可能出現(xiàn)了腸道傳輸性功能加快的發(fā)生;另外，由于5-HT也是重要的免疫調(diào)節(jié)因子，5-HT免疫反應(yīng)細(xì)胞增加也可能提高了機體免疫功能，原結(jié)腸有效的推動性運動減弱得到改善;雖然治療組較模型組杯狀細(xì)胞增多，但與對照組相比，大腸的杯狀細(xì)胞數(shù)量還是減少，(P<0.05)，差異顯著。說明治療組大腸的杯狀細(xì)胞并沒有恢復(fù)到正常水平，這是否與藥物的劑量、給藥時間的不足以及人與動物的體質(zhì)差異有關(guān)，其機制還有待進(jìn)一步研究。

總之，引起藥物依賴性便秘的因素是復(fù)雜的、多方面的，通過從本實驗的研究觀察，肅肺潤腸湯可以改善藥物依賴性便秘大鼠腸道杯狀細(xì)胞、免疫反應(yīng)細(xì)胞5-HT的形態(tài)分布和數(shù)量從而促進(jìn)胃腸蠕動，改善胃腸道的傳輸功能，充分說明中醫(yī)藥治療該病有潛在的前景。