作者;唐永梅，蘇承武，蔡捷，唐東，李佳荃，李梅，田海梅，張偉

［摘要］ 目的 探討體外ATP法化療藥物敏感試驗在乳腺癌細胞中的可行性。方法 以ATP-TCA法，檢測37例乳腺癌患者的癌細胞對6種常用化療藥物的敏感性。結果 ATP-TCA法的可評估率為91.89%；6種試驗用化療藥物的敏感率分別為：足葉乙甙14.71%，紫杉醇20.59%，絲裂霉素32.35%，5-氟尿嘧啶47.06%，草酸鉑58.82%，表阿霉素67.65%。結論 ATP-TCA腫瘤細胞化療藥敏試驗可作為乳腺癌患者個體化療中化療藥物敏感性的預測。 ［關鍵詞］ ATP-TCA法；乳腺癌；化療藥物 Application of ATPbioluminescence assay for screening chemotherapeutic agents of breast tumor ［Abstract］ Objective To study the application of the ex vivo ATPbioluminescence assay(ATP-TCA)in the chemotherapy of breast tumor.Methods The surgical specimens of 37 patients were tested by the ATP-TCA.Results Evaluable test results were achieved in 34 of 37 patients，the evaluability rate was 91.89%.The sensitive rates of etoposid(Vp-16)，paclitaxel(TXL)，mitomycin(MMC)，5-fluoruracil(5-FU)，oxaliplati(OXA)，epirubicin(EPI)was 14.71%，20.59%，32.35%，47.06%，58.82%，67.65%，respectively.Conclusion ATPbioluminescence assay is a good option in the chemotherapeutic agents screening of breast tumors. ［Key words］ ATPbioluminescence；breast tumor；chemotherapy drug 選擇針對個體有效的藥物進行化療是治療乳腺癌的重要手段之一。由于同一化療方案對不同個體的類同腫瘤的療效存在差異，化療前對藥物進行體外敏感試驗，預測出有效的單藥或有效（或敏感）聯合藥物組成的化療方案，是提高化療藥物療效的潛在方法之一。ATP-TCA法（三磷酸腺苷-腫瘤細胞藥敏試驗）是近年發展起來的敏感而穩定的藥敏檢測方法［1］。本文應用ATP-TCA法對37例乳腺癌患者的乳腺癌細胞進行6種化療藥物的藥敏試驗，以探討ATP-TCA法用于乳腺癌患者體外化療藥物檢測在方法學方面的可靠性。 1 材料與方法 1.1 一般資料 收集2003年3月～2005年5月在本院手術治療的乳腺癌（經病理確診）患者37例標 本。37例患者最小年齡25歲，最大年齡65歲。 1.2 材料 ATP-TCA試劑盒（包括改良PRMI-1640培養基）由北京金紫晶生物技術有限公司提供。MPL-1型自發光分析儀為德國Berthold公司產品。化療藥物：5-氟尿嘧啶（5-FU，南通制藥總廠），表阿霉素（EPI，浙江海政制藥），足葉乙甙（VP-16，江蘇恒瑞），紫杉醇（TXL，澳大利亞FH科貿有限公司），絲裂霉素（MMC，日本明治藥廠），草酸鉑（OXA，法國Sanofi Winthrop公司）。 1.3 方法 ATP-TCA操作步驟（按試劑盒使用說明操作）：取腫瘤組織標本，在無菌條件下，剝離腫瘤組織的纖維、脂肪及結締組織，然后用剪刀將腫瘤組織盡可能剪成小碎塊，過200目鋼網后放入腫瘤組織解離酶液中，置37℃、5%CO2、95%濕度下孵育1.5～3h。在室溫下，以1500r/mim條件下離心20min，棄上清液，用Hanks洗2次，以PRMI-1640制成癌細胞懸液，取35μl用臺盼藍染色，顯微鏡下計數，并觀察細胞活性。調整細胞濃度至20～40萬/ml，以每孔0.1ml接種至96孔培養板內。按400%、200%、100%、50%、25%和12.5%的血漿峰值濃度，將藥物加入培養孔每孔0.1ml，每個濃度3個平行孔，并設最大抑制（MI）和無藥物（MO）對照孔，于5%CO2、37℃、95%濕度下孵育6～7天。加入腫瘤細胞ATP提取液0.1ml，混勻后室溫下15min，取0.05ml混合液置微板熒光分析儀檢測。 1.4 ATP-TCA結果評估 1.4.1 應用ATP-TCA的條件 (1)檢測的標本必須經細胞學和病理學證實為惡性腫瘤，且混懸液中腫瘤細胞數 >20%。(2)培養板MO對照行必須可觀察。(3)藥物活性的劑量反應曲線須可觀察。(4)平行孔間CV 值<20%。 1.4.2 ATP-TCA藥物敏感和耐藥的解讀 (1)藥物敏感定義：高AUC（抑制曲線下面積）值，低IC90（抑制90%癌細胞生長時的藥物濃度）、IC50（抑制半數癌細胞生長時的藥物濃度）和SI（敏感指數）值，和高TGI（癌細胞生長抑制）值（表示癌細胞生存100%抑制）。(2)藥物耐受定義：低 AUC值，高IC90、IC50和SI值和低TGI值（特別是在高測試濃度和弱劑量反應時）。(3)敏感度分級，定義為：強敏感：IC90≤ 100%TDC（測試腫瘤藥物濃度）和IC50≤25%TDC。部分敏感： IC90＞100% TDC和 IC50≤25%TDC。弱敏感： IC90≤100%TDC和IC50＞25%TDC。耐藥：IC90>100%TDC和IC50≤25%TDC。 2 結果 在收集的37例患者中，34例具有評估性，總可評估率為91.89%，乳腺癌ATP-TCA試驗藥物劑量效應曲線圖（見圖1）。

ATP-TCA試驗結果顯示不同個體的乳腺癌細胞對6種化療藥物具有不同的敏感性。在所測試的化療藥物中，它們的敏感率排序如下：表阿霉素（EPI）67.65%，草酸鉑（OXA）58.82%，5-氟尿嘧啶（5-FU）47.05%，絲裂霉素（MMC）32.35%，紫杉醇（TXL）20.59%，足葉乙甙（VP-16）14.71%。其中表阿霉素的敏感率最高，足葉乙甙的敏感率最低（見表1）。

3 討論 在本研究中，應用對乳腺癌有較高評估率的ATP-TCA法［2］，對37例乳腺癌患者的癌細胞進行體外化療藥物敏感性檢測方法學的再研究。ATP是活細胞的基本能量單位，當細胞的代謝受損時，ATP合成水平下降，其與活細胞數量呈正相關，故通過測定ATP水平可反映生物體的增殖活性。ATP體外藥敏試驗的原理是細胞內ATP與熒光素-熒光素酶復合物作用產生可測定熒光（波長562nm），檢測熒光值計算出ATP量可反映活細胞數。Sevin等研究認為乳腺癌手術后組織的可評估率為97%，敏感性為90%，特異性為86%，其臨床符合率為70%～80%［2］。本組實驗結果較之為低，這可能與我們的操作不夠熟練、培養過程真菌污染及試驗用藥有關。乳腺癌被認為是一種全身性疾病，對化療中度敏感，Rein等［3］用ATP-TCA法測試晚期乳腺癌體外對蒽環類抗生素、肽素類和鉑類的敏感性，同時用免疫組化法檢測P53、bcl-2的表達，發現體外反應率最高為66.7%，提示化療反應和凋亡無關及P53、bcl-2的表達與體外藥敏結果無關。我們應用北京金紫晶生物技術有限公司提供的ATP-TCA試劑盒，體會到ATP-TCA法有如下優點：（1）成功率及重復性高，達97%；（2）細胞用量少（1.5～2.5）×1011/L；（3）采用熒光檢測范圍較大，且可定量；（4）藥物濃度呈線性范圍，有6個細胞級數，判斷趨勢明顯；（5）干擾因素少；（6）改良的RMPI-1640培養基可選擇性地促進腫瘤細胞生長，并抑制纖維細胞和血細胞的生長［4］。研究表明，ATP-TCA法用于體外乳腺癌患者的癌細胞化療藥物檢測在方法學上是可靠的［5］。因本研究樣本有限，涉及臨床因素不多，藥敏試驗結果與臨床療效一致性有待進一步的研究。

1 Ng TY，Ngan HY，Cheng DK，et al.Clinical applicability of the ATP cell viability assay as a predictor of chemoresponse in platinum-resistant epithelial ovarian cancer using nonsurgical tumor cell samples.Genecol Oncol，2000，76:405-408. 2 Sevin BU，Perras JP.Tumor heterogeneity and in vitro chemosensitivity testing in ovarian cancer.Am J Obstet Gynecol，1997，176(4):759. 3 Ikawa H，Kameda H，Kamitani H，et al.Effect of PPAR activators on cytokinestimulated cyclooxygenase-2 expression in human colorectal carcinoma cells.Exp Cell Res，2001，267(1):73. 4 邵長君，田海梅，傅軍，等.ATP-生物熒光法在篩選卵巢癌化療藥物中的應用.標記免疫分析與臨床，2003，10(3):152-155. 5 齊青萍，高國蘭.ATP腫瘤體外藥敏試驗研究進展.實用癌癥雜志，2004，19(1):106-108.