【摘要】 目的 建立商品肉豆蔻藥材甲醇提取液的指紋圖譜分析方法，以考察不同地區(qū)市售肉豆蔻藥材質(zhì)量的均一性。方法 采用高效液相色譜法，色譜柱為ZORBAX EclipseXDB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相：甲醇-乙腈-水(25∶35∶40)，流速1 mL/min，柱溫：30 ℃；檢測波長：270 nm。以去氫二異丁香酚為參照物。結(jié)果 建立了肉豆蔻藥材的指紋圖譜，共有17個共有峰，指紋圖譜相似度均在0.9以上。結(jié)論 不同地區(qū)市售的商品肉豆蔻藥材無差異性，該法準(zhǔn)確、可靠，為肉豆蔻藥材的質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 肉豆蔻；去氫二異丁香酚；指紋圖譜；高效液相色譜法

Key words：nutmeg；dehydrodiisoeugenol；fingerprint；HPLC 肉豆蔻為肉豆蔻植物肉豆蔻Myristica fragrans houtt.的干燥種仁[1]。由于受到產(chǎn)地來源、貯存時間不詳、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)較低等原因影響，因此，肉豆蔻藥材內(nèi)在質(zhì)量的穩(wěn)定、均一、可控研究尤為重要。本試驗采用高效液相色譜法(HPLC)，以不同地區(qū)商品肉豆蔻藥材為研究對象，建立其甲醇提取液的指紋圖譜分析方法，該法簡便、靈敏、準(zhǔn)確，為肉豆蔻藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Agilent1100高效液相色譜儀(chemistation system工作站)。

1.2 試藥

去氫二異丁香酚對照品[2]，沈陽藥科大學(xué)提供，經(jīng)高效液相色譜法面積歸一化法測定，純度>98.0%；肉豆蔻藥材購于不同地區(qū)，經(jīng)鑒定為肉豆蔻科植物肉豆蔻(Mystica fragrans Houtt.)的干燥種仁，肉豆蔻對照藥材購于中國藥品生物制品檢定所，批號120926-200304。甲醇、乙腈為色譜純，水為重蒸水。

1.3 數(shù)據(jù)處理軟件

國家藥典委員會中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004) A版(中南大學(xué)設(shè)計)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為ZORBAX EclipseXDB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相：甲醇-乙腈-水(25∶35∶40)，流速1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：270 nm。

2.2 參照物溶液的制備

精密稱取去氫二異丁香酚對照品適量，加甲醇制成每1 mL含去氫二異丁香酚0.10 mg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取肉豆蔻粉末(過40目篩)0.5 g，精密稱定，置具塞三角瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理30 min，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液過0.45 μm濾膜，即得供試品溶液。

2.4 檢測方法

參照[《中華人民共和國藥典》2005年版(一部)附錄ⅥD]試驗，分別精密吸取參照物溶液及供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄70 min的色譜圖，即得。

2.5 精密度試驗

精密吸取同一供試品溶液10 μL，在所建立的測定條件下連續(xù)進(jìn)樣5次，采用中藥色譜指紋圖譜的相似性計算軟件計算，結(jié)果5次進(jìn)樣的色譜圖其相似度均為0.9以上，表明儀器精密度良好，符合指紋圖譜要求。

2.6 重復(fù)性試驗

精密稱取同一批樣品各5分，分別按供試品溶液制備方法，精密吸取各供試品溶液10 μL，分別注入液相色譜儀，測定指紋圖譜。采用中藥色譜指紋圖譜的相似性計算軟件對5次測定結(jié)果進(jìn)行計算，結(jié)果各供試品色譜圖其相似度均為0.9以上，表明方法的重復(fù)性良好，符合指紋圖譜要求。

2.7 穩(wěn)定性試驗

精密吸取同一供試品溶液5 μL，按0、2、4、6、8、12、24 h所建立的測定條件進(jìn)行檢測，采用中藥色譜指紋圖譜的相似性計算軟件對所得結(jié)果進(jìn)行計算，其相似度均為0.9以上，結(jié)果表明，在24 h內(nèi)肉豆蔻的色譜指紋圖譜基本穩(wěn)定，沒有明顯的變化，符合指紋圖譜的要求。

2.8 樣品測定

按上述樣品溶液的制備方法及測定方法，對10批不同地區(qū)商品肉豆蔻藥材進(jìn)行測定，記錄色譜圖，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)，對測定結(jié)果進(jìn)行處理，得到各批次樣品的相似度。結(jié)果見表1。表1 10批商品肉豆蔻藥材指紋圖譜的相似度（略）

2.9 指紋圖譜的建立及分析(見圖1～圖4)

按上述方法檢測10批肉豆蔻的指紋圖譜，結(jié)果表明，10批肉豆蔻藥材的指紋圖譜有17個比較穩(wěn)定的特征峰，其中4號峰為去氫二異丁香酚色譜峰。由相似度評價結(jié)果可以看出，10批不同地區(qū)商品肉豆蔻藥材HPLC指紋圖譜的相似度均在0.9以上，未發(fā)現(xiàn)離群樣本。表明各藥材之間相似性良好，初步說明目前各地區(qū)市售的商品肉豆蔻藥材無差異性，質(zhì)量較為穩(wěn)定。

3 討論

試驗中對流動相進(jìn)行了考察，分別采用甲醇-水(70∶30)、甲醇-乙腈-水(30∶30∶40)、甲醇-乙腈-水(25∶35∶40)為流動相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以甲醇-乙腈-水(25∶35∶40)為流動相條件下，分離度好，特征峰全面；方法學(xué)考察試驗結(jié)果證明，該方法準(zhǔn)確、可靠，可用于肉豆蔻藥材指紋圖譜的分析測定[3]。 供試品溶液制備時，曾對提取方法(回流、索氏提取、超聲)、提取時間、提取溶劑(甲醇、乙醇、70%乙醇)進(jìn)行了考察，結(jié)果采用甲醇超聲處理30 min即可提取完全，方法簡便、可行，且甲醇對肉豆蔻中揮發(fā)性及非揮發(fā)性成分均能提取，色譜峰較多。

去氫二異丁香酚是肉豆蔻中非揮發(fā)性成分，含量較高，具有較強(qiáng)的抑菌作用，為肉豆蔻中的活性成分，且性質(zhì)穩(wěn)定，故選擇其為參照物峰，同時結(jié)合其吸收波長及色譜峰數(shù)量、分離程度，經(jīng)篩選確定測定波長為270 nm。 肉豆蔻主要含有揮發(fā)油、脂肪油、木脂素類等多種有效成分，本試驗采用HPLC法對其進(jìn)行指紋圖譜的初步研究。指紋峰不僅包含非揮發(fā)性成分，還能包含揮發(fā)性成分，化學(xué)成分檢測的較多，相比采用氣相色譜法，更能代表肉豆蔻化學(xué)成分的整體性。肉豆蔻藥材多為進(jìn)口，其產(chǎn)地、貯存時間等不太明確，在指紋圖譜研究中發(fā)現(xiàn)雖然相似性均在0.9以上，但10批商品肉豆蔻藥材共有指紋蜂相對峰面積變化變異較大，同時也反映不同地區(qū)商品肉豆蔻化學(xué)成分及本身個體種仁間也可能存在差異，還需進(jìn)一步研究。