作者：李曼玲，馮偉紅，康 琛，梁日欣，楊洪軍，何希榮，黃璐琦

【摘要】 目的 建立丹參藥材水溶性成分中丹酚酸B、丹參素和原兒茶醛的含量測(cè)定方法。方法 采用高效液相色譜法測(cè)定，色譜柱為Kromosil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相Ⅰ：甲醇-乙腈-甲酸-水(30∶10∶1∶59)，流動(dòng)相Ⅱ：甲醇-冰醋酸-水(20∶1∶80)；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)分別為286、280 nm；柱溫35 ℃。結(jié)果 測(cè)定了10個(gè)不同產(chǎn)地的丹參藥材，丹酚酸B含量在0.09%～6.81%之間，平均回收率為99.64%，RSD＝1.09%；丹參素的含量在0.16%～0.68%之間，平均回收率為98.94%，RSD＝1.49%；原兒茶醛的含量在0.01%～0.09%之間，平均回收率為98.96%， RSD＝1.66%。結(jié)論 本法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可作為丹參藥材的含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。

【關(guān)鍵詞】 丹參；丹酚酸B；丹參素；原兒茶醛；高效液相色譜法

Key words：Salvia miltiorrhiza Bge.；Salvianolic acid B；Danshensu；Protocatechuic aldehyde；HPLC

丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根莖，味苦，性微寒，歸心、肝經(jīng)，具有祛瘀止痛、活血通經(jīng)、清心除煩的作用。用于月經(jīng)不調(diào)，經(jīng)閉通經(jīng)，癥瘕積聚，胸腹刺痛，熱痹疼痛，瘡瘍腫痛，心絞痛等。丹參的主要藥效成分之一是丹參中的水溶性成分，主要是酚酸類化合物丹酚酸B、丹參素和原兒茶醛。我們采用HPLC法建立了這3種成分的含量測(cè)定方法，可用于丹參及其飲片和制劑的研究及質(zhì)量控制等。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀：HP1100高效液相色譜儀，G1315A DAD檢測(cè)器，G1311A四元泵，G1313A自動(dòng)進(jìn)樣器，G1316A柱溫箱，G1322A在線脫氣機(jī)，Agilent ChemStation色譜工作站。丹酚酸B對(duì)照品(批號(hào)200201)、丹參素鈉對(duì)照品(批號(hào)855-200102)、原兒茶醛對(duì)照品(批號(hào)0801-9402)均為供含量測(cè)定用，購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所。乙腈：色譜純，美國(guó)；甲醇：色譜純，北京化工廠；高純水：自制；其他試劑均為分析純。丹參藥材由本所生藥室提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 丹酚酸B的含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18(4.6 mm×250 mm， 5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-乙腈-甲酸-水(30∶10∶1∶59)；流速：1 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)λs＝286 nm；理論板數(shù)按丹酚酸B峰計(jì)算應(yīng)不低于4 000。在此條件下丹酚酸 B與其他組分達(dá)到良好分離(見圖1)。

2.1.2 供試品溶液的制備

取本品粉末(過3號(hào)篩)0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇50 mL，密塞，稱定重量，加熱回流1 h，取出，放冷，再稱定重量，用75%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 對(duì)照品溶液的制備

取丹酚酸B對(duì)照品適量，加75%甲醇溶解并制成每1 mL含0.14 mg的溶液，即得。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密吸取對(duì)照品溶液(0.14 mg/mL) 4、8、12、16、20 μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定峰面積。以丹酚酸B的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，以峰面積的積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程：Y＝-0.153 6＋895.6X，r＝0.999 6，結(jié)果表明，丹酚酸B在0.56～2.8 μg范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。

2.1.5 精密度試驗(yàn)

取供試品溶液1份，在上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣5次，每次進(jìn)樣5 μL，測(cè)定丹酚酸B含量，經(jīng)計(jì)算，RSD＝0.28%。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn)

平行制備5份供試品溶液，分別在上述同一色譜條件下，分別進(jìn)樣5 μL，測(cè)定丹酚酸B含量，經(jīng)計(jì)算， RSD＝2.24%。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液1份，上述色譜條件下，分別于樣品制備后第0、1、2、4、8、16、24 h進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定丹酚酸B含量，經(jīng)計(jì)算，RSD＝1.76%。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的丹參藥材粉末，分別加入等量的丹酚酸B對(duì)照品，按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率，丹酚酸B為99.64%，RSD＝1.09%。見表1。表1 丹酚酸B回收率試驗(yàn)結(jié)果（略） 2.1.9 含量測(cè)定

按供試品溶液制備方法，分別對(duì)10個(gè)不同來源丹參藥材丹酚酸B的含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見表2。表2 不同產(chǎn)地丹參藥材丹酚酸B的含量測(cè)定結(jié)果（略）

2.2 丹參素和原兒茶醛的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-冰醋酸-水(20∶1∶80)；流速：1 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)λs＝280 nm。理論板數(shù)按丹參素峰計(jì)算應(yīng)不低于4 000。在此條件下，丹參素、原兒茶醛與其他組分達(dá)到良好分離(見圖2)。

2.2.2 供試品溶液的制備

取丹參藥材粉末(過3號(hào)篩)約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水25 mL，密塞，稱定重量，超聲提取1 h，取出，再加熱回流4 h，取出，密塞，再稱定重量，用水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過。取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取丹參素鈉、原兒茶醛對(duì)照品適量，分別加甲醇溶解，并制成每1 mL分別含丹參素鈉0.08 mg(相當(dāng)于丹參素0.07 mg)、原兒茶醛0.012 mg的溶液，即得。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精密吸取丹參素鈉對(duì)照品溶液(0.08 mg/mL)和原兒茶醛對(duì)照品溶液(0.012 mg/mL)各3、6、9、12、15 μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定峰面積。以丹參素鈉和原兒茶醛的進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，以峰面積的積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算回歸方程。丹參素鈉Y＝-7.147 2＋406.353X，r＝0.999 1；原兒茶醛Y＝-0.772 7＋ 4 943.475X，r＝0.999 2。結(jié)果表明，丹參素鈉在0.24～1.2 μg范圍內(nèi)呈線性關(guān)系；原兒茶醛在0.036～0.18 μg范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗(yàn)

取供試品溶液1份，在上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣5次，每次進(jìn)樣5 μL，測(cè)定丹參素、原兒茶醛含量，經(jīng)計(jì)算，丹參素的RSD＝1.26%，原兒茶醛的RSD＝0.86%，二者之和的RSD＝1.13%。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

平行制備5份供試品溶液，分別在上述同一色譜條件下，分別進(jìn)樣5 μL，測(cè)定丹參素、原兒茶醛含量，經(jīng)計(jì)算，丹參素的RSD＝2.60%，原兒茶醛的RSD＝0.66%，二者之和的RSD＝2.20%。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液1份，在上述色譜條件下，分別于樣品制備后0、1、2、4、8、16、24 h進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定丹參素、原兒茶醛含量，經(jīng)計(jì)算，丹參素的RSD＝0.58%，原兒茶醛的RSD＝1.47%，二者之和的RSD＝0.58%。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的丹參藥材粉末，分別加入等量的丹參素鈉、原兒茶醛對(duì)照品，按上述色譜條件測(cè)定，二者回收率分別為98.94%和98.96%，RSD分別為1.49%和1.66%(見表3、表4)。表3 丹參素鈉回收率試驗(yàn)結(jié)果（略）表4 原兒茶醛回收率試驗(yàn)結(jié)果（略）

2.2.9 含量測(cè)定

按供試品溶液制備方法，分別對(duì)10個(gè)不同來源丹參藥材中的丹參素、原兒茶醛的含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見表5。表5 不同來源丹參藥材中丹參素、原兒茶醛的含量測(cè)定結(jié)果（略）

3 討論 在丹酚酸B含量測(cè)定中，曾經(jīng)試用過甲醇-乙腈-甲酸-水不同配比的流動(dòng)相，結(jié)果正文采用的流動(dòng)相配比分離效果最好，所以最終選擇其作為流動(dòng)相。試驗(yàn)過程中曾對(duì)供試品的提取溶媒、溶媒用量、提取方法、提取時(shí)間等因素進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，正文所列的供試品溶液制備方法為各因素最佳組合。