作者：王祥培，吳紅梅，王祥森，劉霞

【摘要】 目的對不同采收期頭花蓼藥材進行指紋圖譜相似度評價，探索最佳采收期。方法用RP-HPLC(DAD)法，梯度洗脫，測定不同采收期頭花蓼的指紋圖譜，并作相似度比較分析。結果不同采收期頭花蓼的指紋圖譜有明顯差異。結論應注意不同采收季節對頭花蓼藥材的質量影響。

【關鍵詞】 頭花蓼藥材; HPLC指紋圖譜; 相似度

頭花蓼為蓼科植物頭花蓼Polygonum capitatum Buch.-Han.ex D.Don的干燥全草或地上部分，具有清熱利濕，解毒止痛，活血散瘀以及利尿通淋之功效，主治泌尿系統感染、血尿、濕疹、腎盂腎炎等癥[1]。目前測定不同產地、不同采收期頭花蓼藥材中化學成分的含量已有研究報道[2～5]，但頭花蓼化學成分復雜，并且隨著采收期的不同存在差異。因此，為了更全面評價頭花蓼藥材質量和控制質量的穩定性，本文對不同采收期共15批頭花蓼藥材進行了高效液相指紋圖譜研究，并采用國家藥典委員會推薦使用的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件(2004A)”對不同采收期頭花蓼藥材的指紋圖譜進行相似度評價，并以相似度數據進行系統聚類分析，以期為頭花蓼最佳采收期的確定提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料采自西藏墨脫縣墨脫鎮，共15批，經貴陽中醫學院王祥培副教授鑒定為蓼科植物頭花蓼Polygonum capitatum Buch.-Ham.ex D.Don的干燥全草。具體見表1。沒食子酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：0638-9501)，槲皮素對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：081-90003)，槲皮苷對照品(自制，純度﹥98%);乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為重蒸鎦水。

1.2 儀器Agilent1100型高效液相色譜儀(自動進樣品)，二極管陣列檢測器(DAD);《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統A版》(國家藥典委員會)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件采用依利特Hypersil ODS色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，乙腈-0.4%磷酸二元梯度洗脫，體積流量：0.8 ml/min，檢測波長：310 nm，柱溫25℃。

2.2 流動相條件[6]0～5 min：乙腈 0%～5%，0.4%磷酸 100%～95%;5～55 min：乙腈 5%～25%，0.4%磷酸 95%～75%;55～70 min：25%～30%，0.4%磷酸 75%～70%;70～80 min：乙腈 0%，0.4%磷酸 100%;80～85 min：乙腈 0%，0.4%磷酸 100%。

2.3 供試品溶液的制備[6]取頭花蓼細粉(3號篩)2 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，分別加100 ml 80%乙醇，置水浴中加熱回流2 h，濾過，殘渣加100 ml 80%乙醇回流提取1 h，濾過，合并濾液。濾液置蒸發皿中揮干，殘渣加80%乙醇定容置10 ml容量瓶中。用微孔濾膜(0.45 μm) 濾過，取續濾液，即得。

2.4 對照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸、槲皮素和槲皮苷對照品適量，加50%甲醇溶解分別制成0.031 5，0.028 1和0.061 3 mg/ml 的溶液，即得。

2.5 指紋圖譜方法學考察[6]

2.5.1 精密度實驗取同一份供試品溶液，重復進樣6次，測得各共有色譜峰相對留時間及相對峰面積的RSD均低于3%，表明精密度良好。

2.5.2 穩定性實驗取同一份供試品溶液，分別在0，2，6，12，20，30 h進行檢測，測得各共有色譜峰相對保留時間及相對峰面積的RSD均低于3%，表明樣品溶液在30 h內穩定。

2.5.3 重復性實驗取同一采收期的供試品5份，精密稱量，按“2.3”項下制備供試品溶液，分別進樣，測得各共有色譜峰相對留時間及相對峰面積的RSD均低于3%，表明重復性良好。

2.6 指紋圖譜建立 精密吸取對照品與供試品溶液各10μl，注入高效液相色譜儀，按選定的色譜條件，進行檢測。同一實驗條件下，測定所有供試品HPLC色譜圖。根據不同采收時間供試品測定結果所給出的峰數、峰值(積分值)和峰位(相對保留時間)等相關參數進行分析、比較，制定優化的指紋圖譜，見圖1。圖1 不同采收期頭花蓼藥材指紋圖譜

2.7 指紋圖譜分析[6]

2.7.1 共有指紋峰標定 比較不同采收期頭花蓼供試品溶液給出的相關參數，其中13個峰是各批供試品共有，因此確定這13個峰為其共有指紋峰，其中槲皮苷峰較沒食子酸峰及槲皮素峰大，選作為參照峰。

2.7.2 頭花蓼指紋圖譜相似度評價 將15個不同采收期頭花蓼樣品測定數據導入中藥指紋圖譜相似度計算軟件，經選峰，設定匹配模板，將峰自動匹配，然后設定標準模板，進行譜峰差異性評價和整體相似性評價。通過中藥指紋圖譜相似度計算軟件得出頭花蓼HPLC指紋圖譜共有模式，與共有模式比較，15批次不同采收期頭花蓼藥材的相似度結果見表1。

2.8 頭花蓼HPLC指紋圖譜相似度的分類研究 采用SPSS10.0統計軟件對15個樣品的指紋圖譜相似度數據進行系統聚類分析。結果見圖2。從聚類分析結果可以看出，系統將15個樣品分為2大組，2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14為一組，其中4，11，3，12，13為一小組，2，7，8，9，10，14為另一小組，1，5，6，15為一組，說明不同采收期頭花蓼藥材分為2大類，其中以1～4月采收的為一大類，5～12月的為一大類，但9～11月為一小類，5～8月為一小類。表1 不同采收期頭花蓼藥材相似度結果編號 產地 采收時間 相似度 1 西藏墨脫縣墨脫鎮 200503 0.351 2西藏墨脫縣墨脫鎮 200508 0.897 3西藏墨脫縣墨脫鎮 200509 0.963 4西藏墨脫縣墨脫鎮 200510 0.954 5西藏墨脫縣墨脫鎮 200703 0.3716西藏墨脫縣墨脫鎮 200704 0.4657西藏墨脫縣墨脫鎮 200705 0.8248西藏墨脫縣墨脫鎮 200706 0.8519西藏墨脫縣墨脫鎮 200707 0.89110西藏墨脫縣墨脫鎮 200708 0.89911西藏墨脫縣墨脫鎮 200709 0.95512西藏墨脫縣墨脫鎮 200710 0.96813西藏墨脫縣墨脫鎮 200711 0.98114西藏墨脫縣墨脫鎮 200712 0.85215西藏墨脫縣墨脫鎮 200801 0.6211-2005.03，2-2005.08，3-2005.09，4-2005.10，5-2007.03，6-2007.04，7-2007.05，8-2007.06，9-2007.07，10-2007.0811-2007.09，12-2007.10，13-2007.11，14-2007.12，15-2008.01圖2 15批頭花蓼HPLC指紋圖譜相似度聚類譜系圖

3 討論

本文對西藏墨脫縣墨脫鎮同一產地的不同采收期頭花蓼藥材進行指紋圖譜相似度及其系統聚類分析，研究結果顯示1～4月份采收的頭花蓼指紋圖譜相似度較低并歸為一大類，5～12月份采收的頭花蓼指紋圖譜相似度較高，歸為一大類，其中 9～11月份采收的頭花蓼指紋圖譜相似度最高，從不同采收期頭花蓼藥材相似度評價結果和筆者對采收到的藥材性狀來看，建議頭花蓼藥材采收應在5～12月份。研究結果與文獻報道[5]的基本相符，與 2003年版《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》中稱頭花蓼春、夏、秋三季采收有一定的差異。