【摘要】 目的為研究道地藥材五鶴續斷的遺傳多樣性、種類鑒定和基因指紋圖譜的構建等提供基本保證。方法以中藥材五鶴續斷藥源植物的鮮嫩葉片為材料，采用CTAB法并加以改進從中提取出基因組脫氧核糖核酸(DNA)，并檢測其提取效果。結果使用改進的CTAB法從鮮葉中提取五鶴續斷的基因組DNA濃度較高，能滿足PCR反應的要求。結論自行改進的CTAB法提取道地藥材五鶴續斷基因組DNA效果較好。

【關鍵詞】 五鶴續斷; 脫氧核糖核酸(DNA)提取; CTAB法; 改進

道地藥材是傳統中醫藥文化中的精品，是在特定產區的外界環境和產區內該物種的地方種群遺傳性狀等綜合因素的作用下，形成的品質優、療效佳的中藥材[1]。道地藥材與非道地藥材是不同產區的生物品，藥材品質存在差異，但兩者的形態和組織構造差異往往不明顯，難以運用傳統方法準確鑒別藥材道地性。隨著分子生物學的發展，DNA分子鑒定技術及方法已廣泛運用于中藥材道地性與非道地性的鑒定[2]。而DNA的分離純化是DNA分子鑒定等分子生物學操作中的重要步驟，同樣也是藥用植物分子診斷技術中的關鍵環節。由于中藥材中含有的小分子次生物質，如萜類、黃酮、香豆素、有機酸、鞣質等含有酚羥基的化合物，氧化后易與DNA結合，引起DNA降解或抑制酶的活性;而廣泛存在的多糖類由于與DNA同屬大分子化合物，在一般提取過程中很難完全去除。因此有必要不斷摸索并建立不同條件下簡單、快捷、高純度的中藥材基因組DNA提取方法。本實驗就是以道地藥材五鶴續斷的幼嫩葉片為試驗材料，采用自行探索改良的CTAB法對五鶴續斷基因組DNA進行了提取，得到了質量較高的五鶴續斷基因組DNA，為應用于五鶴續斷的遺傳多樣性、種質鑒定和基因指紋圖譜的構建等分子水平的研究提供了基本保證，也為其他道地藥材在分子生物學水平方面的研究提供了一定的參考資料。

1 材料與儀器

1.1 材料五鶴續斷葉片均采自湖北省恩施土家族苗族自治州鶴峰縣走馬鎮萬寺坪道地藥材五鶴續斷GAP研究及種植基地，經湖北民族學院醫學院中藥教研室袁成玉副教授鑒定，用干燥劑將葉片干燥后置于-80℃冰箱備用。

1.2 試劑1mol/L Tris-HCl(pH8.0)，3 mol/L 乙酸鈉，0.5mol/L EDTA(pH 8.0)，1 mol/L NaC1，氯仿/異戊醇24∶1，異丙醇，無水乙醇，70%乙醇，10%CTAB溶液，1.5 x CTAB提取液，CTAB沉淀液，5 mol/L NaC1，1 mol/L乙酸鈉，10mg/ml RNaseA，高鹽TE(含1 mol/L NaC1)，1×TE緩沖液，以上部分是用分析純配制試劑;Taq DNA聚合酶、dNTPs等，購自大連寶生物有限公司;十六烷基三甲基溴化錠(CTAB)為Geneview分裝，購自北京鼎國生物技術有限責任公司;瓊脂糖購自北京華美公司。

1.3 儀器SANYO超低溫冰箱，Eppendorf 低溫高速離心機，Eppendorf 梯度PCR儀，BeckmanD/U530紫外分光光度計，恒溫水浴鍋，DYY-10C水平電泳儀，BIORAD凝膠成像系統，研缽和研棒，移液器。

2 方法

2.1 基因組DNA的提取DNA提取以CTAB常規法[3，4]為基礎。為了克服多酚、多糖等次生物質對DNA純度的干擾，提高獲得DNA的數量和質量，同時還受到條件的限制，本研究對其進行了改良：①選取新鮮幼嫩的五鶴續斷葉片，酒精消毒后快速放入超低溫冰箱;②在沒有液氮的情況下，利用超低溫冰箱的冷凍作用和暗視野效應，再用預冷的研缽和研棒快速粉碎五鶴續斷葉片;③不用飽和酚，增加一次氯仿/異戊醇的用量，避免殘留蛋白質和酚等物質影響DNA的質量;④用1 mol/L NaCl，除去多糖物質，同時可減輕DNA的褐化。

改良后的CTAB法具體提取步驟如下：①快速取出保存在超低溫冰箱中的新鮮葉片3 g，放入已預冷凍的研缽中，迅速研磨成粉末，移入50 ml 離心管;然后加入8 ml的CTAB提取液(先預熱到80℃)，充分混勻，65℃水浴中保溫60 min，其間每20 min反轉搖勻1次，取出樣品，冷卻至室溫;②加入4 ml氯仿，混勻后，平放在震蕩器上搖動10 min至抽提液與氯仿完全混合，室溫下4 000 r/min離心15 min;③將上清液轉移至另一離心管中;加入1/10量的10%CTAB液，搖勻;④加入等體積的氯仿/異戊醇(24∶1)，震蕩15 min至混勻，室溫下4 000 r/min離心5 min;⑤取上清液重復此步驟;⑥取上清液，加入等量的沉淀液，搖勻，室溫放置10m in，然后4 000 rmin離心10 min;⑦取上清液加入1倍體積的預冷異丙醇，混勻，-20℃靜置20 min使沉淀生成，12 000 r/min離心5 min;⑧棄上清液，加入5 ml高鹽TE(含1 mol/L NaCl)和5 μl 10 mg/ml RNase A 在55℃搖床中輕搖至完全溶解;⑨加入1/10體積的3 mol/L乙酸鈉和2倍體積的冰凍無水乙醇，充分混勻，-20℃靜置20 min，使沉淀凝聚，用玻璃棒鉤出呈絮恕狀的DNA，在70%乙醇中洗滌2～3次，最后去除乙醇將沉淀放置風干，加入300 μl TE緩沖液至完全溶解沉淀，再短暫離心。

2.2 DNA的檢測用紫外分光光度法測定 DNA 260 nm 及280 nm 吸光值，然后根據A 260/280值判斷DNA純度并根據DNA 260 nm檢測其濃度。

用瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA樣品：取8 μl DNA樣品在1.0%的瓊脂糖凝膠(含0.5 μl/ml的EB溶液染色)中進行電泳分離，在紫外透射儀下檢測DNA的純度及降解情況。用瓊脂糖凝膠電泳法檢測PCR產物：取8 μl PCR產物在1.0%的瓊脂糖凝膠(含0.5 μl/ml的EB溶液染色)中進行電泳分離，在紫外透射儀下檢測PCR產物的擴增效果。

3 結果與分析

3.1 提取方法的凝膠檢測和PCR反應檢測分析從圖1可以看出，基因組DNA濃度較高，呈現一條亮帶，無降解，說明對五鶴續斷鮮葉采用改進的CTAB法效果較好，能提取得到完整潔凈的基因組DNA。從圖2可明顯發現，用改進后的8個不同來源的基因組DNA為模板在五鶴續斷18S rRNA基因的PCR擴增中均得到理想的帶型。1.利川 2.恩施 3.建始 4.咸豐 5.宣恩 6.鶴峰 7.巴東圖1 五鶴續斷不同產地的樣品DNA電泳圖1.利川 2.恩施 3.建始 4.咸豐 5.宣恩 6.鶴峰 7.巴東圖2 不同產地的五鶴續斷18S rRNA基因的PCR產物電泳圖

3.2 紫外分光光度計檢測由表1可見，對于新鮮葉子采用改良CTAB法260/280值均在1.80～2.00之間。表明改良CTAB法的除雜效果較好。由表2可以看出，改良CTAB法提取的基因組DNA濃度高，與瓊脂糖凝膠電泳(圖1)檢測的結果一致。表1 五鶴續斷不同產地的紫外分光光度計純度檢測結果表2 五鶴續斷不同產地的紫外分光光度計濃度檢測結果

4 結論

道地中藥材用分子生物學方法進行的道地性研究，是近年來發展起來的新的鑒定方法，它可彌補傳統形態學和生化分類鑒定的一些不足[1]。常用于中藥材鑒定的分子生物學方法有RFLP，RAPD，AFLP，SSR，ISSR，DNA序列分析以及基因芯片等技術[5～12]。本研究的方法就采用DNA序列分析的技術來進行道地藥材五鶴續斷的分子鑒定，為五鶴續斷的道地性和分子系統發育關系提供基礎性資料。而進行這項研究關鍵步驟之一就在于提取高濃度的基因組DNA，可為后續實驗提供高質量的目的基因，所以有必要探索五鶴續斷基因組DNA提取的改進方法，為后續實驗打下基礎。

五鶴續斷植株應采集鮮嫩幼葉，此部位有絲分裂旺盛，DNA含量較高，是基因組DNA提取的理想部位。采集后應立即進行消毒，避免提取出其它生物的DNA對五鶴續斷基因組DNA的污染。由于地域限制，再加上液氮運輸不便，不易儲存，故本實驗運用超低溫冰箱-80℃的超低溫冷凍中藥材植株鮮嫩葉片具有與液氮類似效應，同時還具有暗視野效應，較少了葉綠素含量，避免葉綠素對DNA提取的影響，本實驗結果證實此方法較為有效。已有研究發現[13，14]，五鶴續斷等川續斷富含多酚、多糖、蛋白質等復雜的初生及次生代謝產物，這些物質易與DNA不可逆地粘附在一起，從而抑制DNA聚合酶等多種酶的活性，明顯影響后續實驗。故在本實驗中嘗試不用飽和酚，增加一次氯仿/異戊醇的用量，盡量避免殘留蛋白質和酚影響DNA的質量，同時還使用含1 mol/L NaC1的高鹽TE，減少多糖對DNA含量的影響。從實驗結果來看達到了目的，取得了較好的效果，基因組DNA及PCR產物條帶清晰無明顯拖尾等現象。

總之，由于不同植物或同一植物不同組織的結構及生化成分都不相同，而這些結構和成分上的差異對DNA的不同提取方法往往會造成不同程度的影響，導致不同提取方法所得DNA在純度和產量上的差異。因此，在實際工作中，應自行根據試材的生化成分和材料保存時間、方法等來篩選或建立適當的提取方法。