作者：張金紅，周晶，宋慧琴，吳志麗

【摘要】 目的建立堿水解法提高黃芪藥材中黃芪甲苷收率的最佳工藝。方法以黃芪甲苷的收率為考察指標(biāo)，采用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)黃芪甲苷的提取工藝進(jìn)行優(yōu)選。考察NaOH濃度、水解時(shí)間及料液比對(duì)黃芪甲苷收率的影響，采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法(HPLC-ELSD)測定其含量。結(jié)果NaOH溶液的濃度對(duì)黃芪甲苷的收率起主要作用，最佳工藝條件為：NaOH溶液的濃度為0.100 mol·L-1，室溫靜置水解2 h，黃芪藥材與堿溶液的料液配比為1∶12，黃芪甲苷的含量約是未經(jīng)堿水解組的16.4倍。結(jié)論堿水解法可顯著提高黃芪藥材中黃芪甲苷的含量。方法簡便易行，實(shí)用價(jià)值高，為工業(yè)化生產(chǎn)提供了依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 堿水解法; 黃芪; 黃芪甲苷; 正交試驗(yàn)

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. var. mongholicus (Bge.) Hsiao或膜莢黃芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge的干燥根。黃芪皂苷是黃芪的主要藥效物質(zhì)之一，黃芪皂苷大部分是以環(huán)黃芪皂醇為苷元的皂苷，黃芪甲苷(astragaloside Ⅳ)為其主要成分[1]，常作為黃芪藥材及其制劑的質(zhì)量控制定量的指標(biāo)。藥理研究表明，黃芪甲苷具有強(qiáng)心護(hù)心、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)及內(nèi)皮屏障功能、改善血液流變學(xué)、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、抗衰老、抗胃潰瘍等功能，此外，還具有降血壓、鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜、促進(jìn)胰島素分泌等作用[2]。黃芪甲苷雖然藥理作用顯著，但其在黃芪藥材中的含量很低，提取分離較困難，使其應(yīng)用受到極大的限制。本研究利用皂化反應(yīng)原理，在NaOH作用下將環(huán)黃芪醇皂苷轉(zhuǎn)化為黃芪甲苷，通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選黃芪甲苷轉(zhuǎn)化的最佳條件，提高黃芪甲苷的收率，為黃芪甲苷單體制劑的研制開發(fā)奠定研究基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Agilent 1100高效液相色譜儀，Alltech 2000ES型蒸發(fā)光散射檢測器，AT-330柱溫箱(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)，XWK-3A空氣泵(天津市華生分析儀器廠);SZ-93自動(dòng)雙重純水蒸餾水器(上海強(qiáng)運(yùn)科技有限公司);BP-211D電子分析天平(德國賽多利斯公司);KS-600D超聲清洗機(jī)(寧波科生儀器廠);W2-100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司);PHS-25型酸度計(jì)(杭州亞美電子儀器廠)。

1.2 試藥黃芪甲苷對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)為110781-200613);黃芪藥材(購自天津市藥材公司，批號(hào)為Y0805267，由天津醫(yī)科大學(xué)生藥學(xué)教研室周曄教授鑒定，符合《中國藥典》2005年版Ⅰ部要求);AB-8型大孔吸附樹脂(南開大學(xué)樹脂廠);乙腈(天津康科德科技有限公司，批號(hào)：080426)色譜純，氫氧化鈉為分析純;流動(dòng)相用水為重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)色譜柱：Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動(dòng)相：乙腈-水(34∶66);體積流量：1.0 ml·min-1;柱溫：35 ℃;漂移管溫度：105 ℃;載氣流量：2.5 L·min-1;壓力：0.4 MPa;進(jìn)樣量：10 μl。此色譜條件下，黃芪甲苷色譜峰與樣品中其他組分色譜峰可達(dá)基線分離，分離度大于1.5，理論塔板數(shù)以黃芪甲苷峰計(jì)不低于4 000。

2.2 黃芪藥材提取液的制備稱取黃芪藥材200 g，置于圓底燒瓶中，各次加乙醇量分別為藥材干重的10，8，8倍，90 ℃水浴回流提取3次，各次回流時(shí)間分別為2，1.5，1 h。每次回流后趁熱過濾，濾液合并濃縮后定容至500 ml，備用。精確吸取上述提取液5 ml，按設(shè)定的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行水解后，調(diào)節(jié)pH至中性，上AB-8型大孔吸附樹脂，流出液重復(fù)上樣一次，用3 BV蒸餾水洗脫樹脂，再用4 BV 70﹪乙醇洗脫樹脂，收集70﹪乙醇洗脫液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮近干，用70﹪乙醇溶解并定容于10 ml量瓶中，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得黃芪藥材樣品液。a.黃芪甲苷對(duì)照品;b.堿水解前樣品;c.堿水解后樣品;1.黃芪甲苷圖1 黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品及黃芪藥材提取液堿水解前后的HPLC圖

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系的考察準(zhǔn)確稱取經(jīng)減壓真空干燥至恒重的黃芪甲苷對(duì)照品24.7 mg，置于50 ml量瓶中，加甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為儲(chǔ)備液。分別精密吸取黃芪甲苷對(duì)照品儲(chǔ)備液0.25，0.5，1，2，4，6，8 ml，置于10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，分別精密吸取上述溶液各20 μl，注入高效液相色譜儀，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定黃芪甲苷的峰面積，以黃芪甲苷進(jìn)樣量(μg) 的自然對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)(X)，以峰面積的自然對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程，Y=1.376 8X+12.829，r=0.999 8。黃芪甲苷在0.247～7.904 μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.3.2 精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取黃芪甲苷對(duì)照品溶液10 μl，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定黃芪甲苷峰面積值RSD為1.02﹪(n=6)，表明儀器的精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取同一份堿水解工藝制備的黃芪藥材供試液，于0，2，4，8，12，24 h分別進(jìn)樣，測定黃芪甲苷峰面積值RSD為1.34﹪(n=6)，表明黃芪藥材供試液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)精密吸取6份黃芪藥材提取液各5 ml至50 ml圓底燒瓶中，按照相同的堿水解工藝條件制備黃芪藥材供試液，測定并計(jì)算黃芪甲苷的含量，RSD為1.68﹪(n=6)，表明本處理方法制備黃芪甲苷的重復(fù)性良好。

2.3.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)取經(jīng)堿水解工藝制備的已知黃芪甲苷含量的供試液2.5 ml至10 ml量瓶中，共9份，每份分別按相當(dāng)于堿水解后黃芪供試液中黃芪甲苷含量的80﹪，100﹪，120﹪加入黃芪甲苷對(duì)照品溶液，加70﹪乙醇定容至刻度，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，測定并計(jì)算黃芪甲苷的回收率。結(jié)果表明，黃芪甲苷的平均回收率分別為98.26﹪，100.21﹪和97.53﹪，RSD分別為1.45﹪，1.22﹪和1.03﹪。

2.4 正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化黃芪藥材的堿水解工藝在考察了NaOH濃度，堿水解時(shí)間和料液比等單因素對(duì)黃芪甲苷轉(zhuǎn)化率影響的基礎(chǔ)上，對(duì)上述因素水平設(shè)計(jì)L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，以每克黃芪生藥中含有黃芪甲苷的量(mg)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選最佳工藝。各因素水平見表1。表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表L9

2.4.1 正交實(shí)驗(yàn)樣品的制備及測定 精確吸取“2.2”中未經(jīng)堿水解的黃芪提取液5 ml，按表2正交實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行水解后，繼續(xù)按“2.2”項(xiàng)下操作，每次實(shí)驗(yàn)平行2份。照“2.1”項(xiàng)下色譜條件以外標(biāo)兩點(diǎn)法對(duì)數(shù)方程計(jì)算黃芪甲苷的含量。結(jié)果見表2。表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果由表3可知，因素A(NaOH濃度)對(duì)黃芪中黃芪甲苷的收率具有顯著性影響(P< 0.05);因素B(水解時(shí)間)和因素C(料液比)對(duì)黃芪甲苷的收率無顯著影響。因此，因素A為主要因素，因素B和C為次要因素，該結(jié)論與直觀分析法是一致的。因此，結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)，本實(shí)驗(yàn)的最佳搭配為A3B2C3，即濃度0.100 mol·L-1的NaOH室溫靜置水解2 h，料液比為1∶12。表3 方差分析表

2.4.2 堿水解工藝的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步考察上述最佳工藝的穩(wěn)定性及合理性，將藥材量放大10倍，即取相當(dāng)于20 g黃芪藥材的提取液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，按照該工藝進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)3次，隨行進(jìn)行非水解空白組。結(jié)果見表4。表4 最佳工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果由表4可以看出，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中黃芪甲苷的含量均高于正交實(shí)驗(yàn)各組的含量，經(jīng)過最佳堿水解工藝水解后的黃芪甲苷含量比未經(jīng)堿水解組明顯增高，約是未經(jīng)堿水解的黃芪皂苷樣品中黃芪甲苷含量的16.4倍，說明本實(shí)驗(yàn)確定的黃芪皂苷的最佳堿水解工藝穩(wěn)定可行，對(duì)于黃芪甲苷的生產(chǎn)具有很大的實(shí)用價(jià)值。

2.4.3 堿水解前后黃芪總皂苷的含量[3]精密稱取未經(jīng)堿水解和堿水解后提取所得黃芪皂苷粗品各約12.5 mg，用無水乙醇超聲溶解并定容于25 ml量瓶中，過濾，取濾液作為樣品液。精密吸取0.3 ml樣品液，各加無水乙醇至0.5 ml，再分別加入0.5 ml 8%香草醛無水乙醇試劑，置于冰浴中緩緩加入5.0 ml 72%(V/V)的硫酸，旋渦混勻2 min，放入62℃水浴中，保溫30 min，取出，置冰浴冷卻10 min，搖勻，立即于波長540 nm處測定吸光度，隨行試劑空白，測定3次，每個(gè)樣品平行做3份。表5 堿水解前后黃芪總皂苷的含量由表5可以看出，黃芪皂苷堿水解前后黃芪總皂苷的含量變化不大，采用配對(duì)t檢驗(yàn)，兩者的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，尚不能認(rèn)為黃芪總皂苷堿水解前后的含量有變化。說明該方法不影響黃芪總皂苷的含量，而是提高了活性較強(qiáng)的黃芪甲苷的含量。

3 討論

國內(nèi)外學(xué)者[1]對(duì)黃芪中黃芪皂苷作了深入的研究，已分離鑒定了數(shù)十種黃芪皂苷，其中大多數(shù)皂苷以環(huán)黃芪皂醇為苷元，以配糖體部分不同而分類，黃芪甲苷糖體3個(gè)位置均連著-OH，其它環(huán)黃芪醇皂苷的配糖體上連接-OH或-OAc，本研究的皂化反應(yīng)原理就是將黃芪中的環(huán)黃芪醇皂苷轉(zhuǎn)化為黃芪甲苷，從而提高黃芪中黃芪甲苷的收率及藥用價(jià)值。

在設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)之前，本文對(duì)黃芪皂苷的水解方法進(jìn)行了篩選，分別采用了加熱回流法和室溫靜置法進(jìn)行黃芪提取液的堿水解，經(jīng)過t檢驗(yàn)，結(jié)果表明，加熱回流法與室溫靜置水解法對(duì)黃芪提取液中黃芪甲苷的收率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，為節(jié)約成本消耗，更適用于工業(yè)生產(chǎn)的需要，本研究選用了室溫靜置水解法對(duì)黃芪提取液進(jìn)行黃芪皂苷的水解。

《中國藥典》(2005年版)[4]中對(duì)黃芪甲苷含量測定的前處理中，采用了氨試液洗滌正丁醇萃取液，以使黃芪中黃芪甲苷的含量達(dá)到測定的要求，但經(jīng)過反復(fù)洗滌，黃芪甲苷的損失率會(huì)大大增加，且氨試液刺激性大。有研究[5]采用2%氨液90 ℃水浴回流2 h，用于提高黃芪中黃芪甲苷的收率，但該法中氨試液濃度較大，且加熱回流消耗成本高，污染環(huán)境。因此，本研究采用了濃度為0.100 mol·L-1氫氧化鈉在室溫靜置堿水解，減少了氨試液對(duì)環(huán)境的污染，降低成本消耗，該操作方法易于在工業(yè)生產(chǎn)中實(shí)施。