作者：范成杰，劉友平，陳鴻平，石宇華

【摘要】 目的應(yīng)用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定烏梅藥材中齊墩果酸和熊果酸的含量，并以齊墩果酸和熊果酸為指標(biāo)成分建立烏梅肉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法采用Hypersil ODS C18(150 mm×4.6 mm， 5 μm)；甲醇－0.2%乙酸銨水溶液（83∶17）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長210 nm，流速0.8 ml/min，柱溫25℃。結(jié)果齊墩果酸的線性范圍為0.168～1.512 μg，r＝0.999 6，回收率為98.00%（RSD=0.53%）；熊果酸的線性范圍為0.452～4.068 μg，r=0.999 9，回收率為97.13%（RSD=1.17%）。結(jié)論該方法簡便、可靠、準(zhǔn)確，可用于烏梅藥材中齊墩果酸和熊果酸的含量比較和烏梅肉的質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】 高效液相色譜法 烏梅肉 齊墩果酸 熊果酸

Abstract：ObjectiveTo determine the ursolic acid and oleanolic acid in the pulp of Fructus Mume by HPLC. MethodsThe ursolic acid and oleanolic acid were separated on C18 column.Methanol-0.2% Ammonium acetate solution (83∶17) was used as mobile phase and the detection wavelength was 254nm.ResultsThe linearity of ursolic acid and oleanolic acid was in the range of 0.168～1.512μg， 0.452～4.068μg， respectively; the average recoveries of ursolic acid and oleanolic acid were 98.00%(RSD=0.53%，n=5) and 97.13%(RSD=1.17%，n=5). ConclusionThe method is simple， quick and reproducible，and it can be used for the quality control of the pulp of Fructus Mume.

Key words：HPLC; Pulp of Fructus Mume; Ursolic acid; Oleanolic acid 烏梅，別名酸梅、黑梅，由薔薇科植物梅Prunus mume (Sieb.) Sieb. et Zucc.（Armeniaca mume Sieb.）的干燥近成熟果實(shí)加工而成。關(guān)于烏梅的入藥方式，歷代本草記載有去核和連核使用兩種，現(xiàn)代研究證明烏梅中有效成分有機(jī)酸及水浸出物大多集中在果肉中，核含量甚少［1］，且核仁含大量脂肪油成分，具滑泄作用，與烏梅的固澀作用相駁；同時(shí)也有報(bào)道認(rèn)為烏梅核特征明顯，有利于烏梅的鑒定，而且烏梅核還含有約5％的有機(jī)酸，且去核繁瑣費(fèi)時(shí)費(fèi)工［2］，所以烏梅是否應(yīng)分部位藥用仍存在爭議。《中國藥典》Ⅰ部（2005年版）中，凈烏梅和烏梅肉都有收載［3］。因此明確烏梅的入藥方式，是建立烏梅規(guī)范的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的前提。本課題組前期對(duì)烏梅各部位的化學(xué)成分進(jìn)行了初步比較研究，結(jié)果表明烏梅各部位的藥理作用不同，代表烏梅澀腸止瀉作用的主要藥用部位為烏梅果肉。本實(shí)驗(yàn)以齊墩果酸和熊果酸為對(duì)照品，建立了烏梅果肉中齊墩果酸和熊果酸的RP-HPLC含量測(cè)定方法，為烏梅肉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)范奠定了基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

島津LC-10A高效液相色譜儀，島津工作站（日本島津公司）；高效液相色譜柱［Hypersil-ODS C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），大連依利特公司］；BP211D（十萬分之一），BP121S（萬分之一）型電子分析天平（德國Sartorius公司）；BUG25-12超聲波清洗機(jī)（25 kHz，500 W，上海必能信超聲波有限公司）。

1.2 試劑

齊墩果酸對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，供含量測(cè)定，批號(hào)：709-8501），熊果酸對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，供含量測(cè)定，批號(hào)：110742-200314）。甲醇為色譜純，水為超純水；其余試劑均為分析純。

1.3 樣品

藥材采或購自不同產(chǎn)地，均經(jīng)鑒定。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)

色譜柱為Hypersil ODS C18(150 mm×4.6 mm， 5 μm)； 流動(dòng)相為甲醇－0.2%乙酸銨水溶液（83∶17）；檢測(cè)波長為210 nm；流速0.8 ml/min，柱溫25℃。在此條件下分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液各5 μl注入液相色譜儀。結(jié)果，對(duì)照品采用峰面積歸一化法計(jì)算，二者含量>98％。在此色譜條件可將供試品溶液中齊墩果酸、熊果酸與其它成分峰分離，分離度達(dá)1.2，理論塔板數(shù)應(yīng)不低于3 000。對(duì)照品溶液、供試品溶液的色譜圖見圖1～2。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取齊墩果酸對(duì)照品10.50 mg，置25 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為齊墩果酸對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密稱取熊果酸對(duì)照品11.31 mg，置10 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為熊果酸對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別從兩種儲(chǔ)備液中精密量取1ml溶液，置同一5 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得（每毫升含齊墩果酸84 μg，含熊果酸226 μg）。

2.3 供試品溶液的制備

取烏梅果肉粗粉約4 g，精密稱定，置具塞三角瓶中，精密加入甲醇50 ml，密塞，稱定重量，超聲處理（25 kHz，500 W ）50 min，放至室溫，再稱定重量，以甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液20 ml，置蒸發(fā)皿中蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至5 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取對(duì)照品溶液2，6，10，14，18 μl 進(jìn)樣，分別以齊墩果酸、熊果酸峰面積積分值（Area）為縱坐標(biāo)，其含量（Amt）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算回歸方程，齊墩果酸的回歸方程為A＝493 338(Amt)+10 620，相關(guān)系數(shù)為r＝0.999 6，齊墩果酸含量在0.168～1.512μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。熊果酸回歸方程為A＝524917 (Amt)+9640.4，相關(guān)系數(shù)為0.999 9，熊果酸含量在0.452～4.068 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取烏梅肉藥材，依法制備供試品溶液，室溫放置，在0，4，8，12，24 h分別進(jìn)樣5 μl，測(cè)得齊墩果酸的含量RSD為1.25%，熊果酸的含量RSD為1.46%。實(shí)驗(yàn)表明：樣品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6 精密度實(shí)驗(yàn)取同一對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，每次5μl，齊墩果酸峰面積積分值的RSD為0.53%，熊果酸峰面積積分值的RSD為1.17%。表明精密度符合要求。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取樣品適量，精密稱取5份，分別按“2.3”項(xiàng)下的方法操作，分別測(cè)定齊墩果酸、熊果酸含量，測(cè)得齊墩果酸的含量RSD為2.10%，熊果酸的含量RSD為1.57%。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

取烏梅果肉粉末5份，每份約2 g，精密稱定，精密加入齊墩果酸對(duì)照品0.464 mg，熊果酸對(duì)照品1.895 mg，以后按供試品溶液制備方法制備供試液，精密吸取續(xù)濾液5 μl，對(duì)照品溶液5 μl，分別注入液相色譜儀，測(cè)定含量，計(jì)算加樣回收率（本品另同時(shí)測(cè)定，含齊墩果酸0.2451 mg/g，熊果酸0.885 5 mg/g）。平均回收率齊墩果酸為98.00%，熊果酸為97.13%。

2.9 烏梅不同入藥部位的測(cè)定

分別取烏梅核殼和種子粉末各約4 g，按供試品溶液的制備方法制成供試液，按上述色譜條件分別精密吸取烏梅果肉供試品溶液、烏梅核殼供試品溶液、烏梅種仁供試品溶液各5μl注入液相色譜儀。測(cè)定。結(jié)果核殼和種子樣品在齊墩果酸、熊果酸相對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間未出峰，與果肉樣品HPLC圖譜比較，三者有明顯區(qū)別。烏梅果肉供試品溶液、烏梅核殼供試品溶液、烏梅種仁供試品溶液的色譜圖見圖2～4。

2.10 不同產(chǎn)地樣品測(cè)定

按前述方法制備各供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算含量。結(jié)果見表1。表1 不同產(chǎn)地及品種烏梅肉樣品中齊墩果酸、熊果酸含量測(cè)定結(jié)果（略）

根據(jù)11批烏梅果肉樣品中齊墩果酸和熊果酸含量測(cè)定結(jié)果，其中10批樣品齊墩果酸和熊果酸的總量在1.0 mg/g以上。

3 討論

關(guān)于烏梅的入藥方式一直存在爭議。本課題組首先對(duì)烏梅各部位即果肉、核殼、種仁的藥理作用進(jìn)行了初步比較研究，結(jié)果表明烏梅各部位藥理作用不同［4］。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法對(duì)烏梅果肉、核殼和種仁的化學(xué)成分進(jìn)行了比較，結(jié)果表明齊墩果酸和熊果酸僅存在于果肉部位，這為烏梅各部位藥理作用的差異提供了物質(zhì)基礎(chǔ)依據(jù)，進(jìn)一步證明了烏梅應(yīng)分部位藥用的必要性。提示應(yīng)分別建立各部位的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，保證臨床用藥的安全有效。

有文獻(xiàn)報(bào)道烏梅僅含熊果酸而不含齊墩果酸［5］。 本研究首次發(fā)現(xiàn)烏梅果肉中齊墩果酸和熊果酸兩者同時(shí)存在，因此本研究以齊墩果酸和熊果酸為對(duì)照品，建立了用烏梅果肉中齊墩果酸和熊果酸的反相HPLC含量測(cè)定方法。

【參考文獻(xiàn)】 ［1］張麗麗，耿小平. 烏梅、醋烏梅等有機(jī)酸及水浸物含量比較［J］.山東中醫(yī)雜志，1999，8(8):370. ［2］胡彩霞，姜世秋.小議烏梅炮制與用量［J］.時(shí)珍國藥研究，1998，9(1):18. ［3］國家藥典委員會(huì).中國藥典，Ⅰ部［S］. 北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:54. ［4］陳 林，陳鴻平，劉友平.烏梅不同部位藥理作用比較研究［J］.中國藥房，2007，18(27):2089. ［5］陰 健.中藥現(xiàn)代化研究與應(yīng)用(2)［M］.北京:中醫(yī)古籍出版社，1995:75.