作者：陳磊 李遠 趙中流 田薇

【摘要】 目的以腫節風藥材為原料，并用RP-HPLC(反相高效液相色譜)外標法進行含量測定。方法在單因素試驗的基礎上，選取提取溶劑、提取方法和提取液pH值這3個因素進行了3因素2水平的正交試驗，進而篩選出最優的水平組合。結果提取腫節風藥材中反丁烯二酸的最佳提取工藝是：提取液pH值為4.0；提取方法為微波提取5.0 min；提取溶劑為70％乙醇溶液。結論實驗結果為確定腫節風藥材中反丁烯二酸提取工藝提供了實驗依據。

【關鍵詞】 腫節風 提取工藝 反丁烯二酸 正交實驗

Abstract：ObjectiveTo determine the content of the fumaric acid which was extracted from Herba Sarcandrae by RPHPLC.MethodsOn the basis of the single factor experiment， three factors were chosen with orthogonal design: extraction solvent，extraction method， PH value， then the optimal combinations of levels was defined. ResultsThe results showed that the optimal combinations of levels of extracted fumaric acid from Herba Sarcandrae were extracted with 70% ethanol and microwave irradiation for 5 minutes， and the pH value was 4.0. ConclusionThe result provides a technology for the extraction of fumaric acid from Herba Sarcandrae.

Key words：Herba sarcandrae; Extraction; Fumaric acid; Orthogonal test

腫節風Herba Sarcandrae (英)為2005版《中國藥典》第Ⅰ部收載品種，為金粟蘭科Chloranthaceae植物草珊瑚Sarcandra glabra (Thunberg) Nakai的干燥全株［1］?，F代藥理和毒理研究表明腫節風具有抗菌消炎、抑制流感病毒、抗腫瘤、促進骨折愈合及鎮痛等多種活性［2～4］。其中，有機酸類成分反丁烯二酸具有抗菌消炎的藥理活性［5］。目前，在質量控制上針對腫節風藥材的含量測定指標共有3個。即異秦皮啶、反丁烯二酸和總黃酮［5］。這些化學成分(或有效部位) 已經藥理實驗證明具有一定的抗菌、消炎、止痛或抗腫瘤活性。資料表明，《中國藥典》和部頒標準中腫節風藥材及其制劑的質量控制指標多為單一成分。此外，已有的研究資料表明，對腫節風及其制劑化學成分的定性定量分析雖有較多報道，但單獨針對腫節風藥材中的反丁烯二酸提取工藝進行研究的尚未見報道。因此，通過不同工藝方法來提取腫節風藥材中的反丁烯二酸，并應用HPLC法測定其含量，然后分析不同方法對含量測定結果的影響，進而確定最佳提取工藝，可以為腫節風藥材質量控制提供依據。

1 器材

腫節風藥材，市售（浙江省臨安市益壽堂藥店），產于長江以南各省；95%乙醇，丙酮均為分析純（衢州巨化試劑有限公司），甲醇為一級色譜純（天津市四友精細化學品有限公司），乙腈為特級色譜純（天津市四友精細化學品有限公司）；對照品為反丁烯二酸（≥99％），含量測定專用；Waters515高效液相色譜儀，包括2695四元數碼泵，2420蒸發光閃射（紫外）檢測器，EMPOWER2 色譜管理系統等；精密分析天平（FA2104N）；無級可調臺式超聲清洗器（SK8200HP）；微波提取設備（NJ107-3）等。

2 方法

2.1 樣品中反丁烯二酸的含量測定

2.1.1 色譜條件［6］

色譜柱為C18對稱柱（4.6 mm×250 mm)；流動相為0.08％磷酸乙腈（9:1，V/V）；流速0.6 ml/min；柱溫為室溫；檢測波長220 nm。

2.1.2 樣品溶液的制備準確稱取0.15g腫節風藥材粉末加75%乙醇30 ml，置50 ml錐形瓶中 →（加濃HCl， 調節pH值） → 冷浸8～9 h → 提取 → 抽濾 → 恒溫水浴中，濃縮蒸干 → 加甲醇（色譜純）溶解，轉移至10 ml容量瓶，定容 → 0.45 μm微孔濾膜過濾 → 即得樣品溶液

2.2實驗方案

2.2.1 單因素實驗

提取溶劑對樣品溶液中富馬酸含量的影響:按照“2.1.2”項樣品溶液制備的工藝流程，改變提取溶劑進行實驗，不調pH值，并采用超聲提取法，提取時間為1.5 h；提取溶劑分別為：水、丙酮、70％乙醇；制備樣品溶液，并計算樣品溶液中的反丁烯二酸含量。 提取方法對樣品溶液中富馬酸含量的影響：按照“2.1.2”項樣品溶液制備的工藝流程，改變提取方法，提取溶劑為70％乙醇，不調pH值；提取方法分別為：超聲提取1.5 h，索氏提取4 h（提取前不冷浸）；制備樣品溶液，并計算樣品溶液中的反丁烯二酸含量。

2.2.2 正交實驗設計［7］

根據文獻資料和單因素實驗的結果，選取了以下3個因素：提取溶劑、提取方法、提取液pH值，并按照正交實驗表L4(23)進行正交實驗。

3 結果

3.1樣品

中反丁烯二酸的含量測定結果反丁烯二酸標準品的HPLC檢測結果見圖1。

3.2 方法

學考察線性關系實驗：精密稱取反丁烯二酸0.06 g加甲醇定容至25 ml容量瓶，搖勻，用移液管從中移取1 ml，加甲醇定容至100 ml容量瓶，搖勻，再用移液管分別移取該溶液1，5，10，15，20 ml，并分別加甲醇，定容至25 ml容量瓶，搖勻，即得不同濃度的對照品。 分別吸取不同濃度的對照品進樣10 μl，計算回歸方程。結果顯示：回歸方程為Y＝1.964×105X，r=0.998 1。表明反丁烯二酸對照品溶液在0～23.424μg/ml濃度范圍內與峰面積呈良好的線性關系。反丁烯二酸標準曲線見圖2。

精密度實驗：精密移取對照品10 μl，重復進樣5次，測定每次進樣后反丁烯二酸峰面積的值。測定每次進樣后反丁烯二酸峰面積的值分別為2 793 074，2 787 123，2 787 156，2 806 023，2 806 991，其RSD為0.35％，結果表明儀器精密。

回收率實驗：精密稱取反丁烯二酸0.010 9 g，即備用的對照品溶液A濃度為109 μg/ml。精密稱取藥材粉末0.15 g 5份分別置50ml容量瓶中，再精密吸取對照品溶液A各1 ml，分別置上述容量瓶中，按“2.1.2“樣品溶液制備的工藝流程，制備樣品溶液?；厥章视嬎愎饺缦拢夯厥章?%)＝(C-A)/B×100其中A為已知被測物含量的樣品，B為加入的被測物量，C為測出的含量。結果見表1。表1 反丁烯二酸回收率測定結果（略）

穩定性實驗：精密稱取藥材粉末0.15 g 5份分別置50 ml容量瓶中，按“2.1.2”項樣品溶液制備的工藝流程制備樣品溶液。取平行樣5份。結果見表2。表2 最優提取工藝提取的樣品溶液測定結果（略）

3.3 單因素實驗結果

3.3.1 提取溶劑的選擇 提取溶劑與樣品溶液中富馬酸百分含量的關系（見圖3）。結果顯示，采用70％的乙醇作為提取溶劑的樣品溶液中富馬酸百分含量最高，其次為水，最低的為丙酮；表明提取樣品中的富馬酸，在同等條件下，70％的乙醇提取效果最好。 3.3.2 提取方法的選擇提取方法與樣品溶液中富馬酸百分含量的關系，如圖4所示。結果顯示：采用超聲提作為提取方法的樣品溶液中富馬酸百分含量最高，其次為索氏提??；表明提取樣品中富馬酸，在同等條件下，超聲提取1.5 h的效果較好。