作者：周欣， 陳華國，趙超，龔小見，李明

【摘要】 目的建立蓬莪術(shù)藥材揮發(fā)性成分的氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用分析（GC-MS）指紋圖譜，為蓬莪術(shù)藥材的質(zhì)量控制提供參考。方法采用水蒸氣蒸餾法提取蓬莪術(shù)揮發(fā)油，用GC-MS聯(lián)用技術(shù)對其進行指紋圖譜測定，并且利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件”對不同樣品之間的相似度進行計算。結(jié)果初步建立了蓬莪術(shù)揮發(fā)油的GC-MS指紋圖譜，標定了20個共有峰，各批次藥材均有上述特征，但特征峰的相對含量存在一定差異。結(jié)論該方法有良好的重現(xiàn)性和精密度，再加上GC-MS具有多成分同時定性的優(yōu)勢，所建立的蓬莪術(shù)揮發(fā)油的GC-MS指紋圖譜為其質(zhì)量控制提供了科學依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 蓬莪術(shù) 揮發(fā)油 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用 指紋圖譜

Abstract：ObjectiveTo establish a method of fingerprint analysis on volatile oil of Curcuma phaeocaulis Valeton by GC-MS. MethodsThe essential oil of Curcuma phaeocaulis Valeton growing in Shuangliu city of Sichuan province was extracted by steam distillation and the chromatographic fingerprint was characterized by GC-MS. The GC-MS analysis was carried out in a Hewlett Packard model 6890 gas chromatograph coupled with a Hewlett Packard model 5973 mass detector. A Hewlett Packard HP-5 (5% phenyl methyl siloxane) fused silica capillary column (30 m×0.25 mm I. D.， 0.25μm film thickness) was used for the separation. ResultsWe established Mutual fingerprint of the essential oil of Curcuma phaeocaulis Valeton by using the similarity calculation software of Chinese herbal fingerprint designed by Research Center of Modernization of Chinese Herbal Medicines of Central South University RSD of precision and reproducibility and stability of this GC-MS method was in the range of 5%. Compared with Mutual fingerprint of the essential oil of Curcuma phaeocaulis Valeton， the coefficients of 10 samples of the essential oil of Curcuma phaeocaulis Valeton were all above 90%， without abnormal sample.ConclusionThe method is reliable， accurate and can be used for quality control of essential oil of Curcuma phaeocaulis Valeton.

Key words：Curcuma phaeocaulis Valeton ; Essential oils; GC-MS; Fingerprint 莪術(shù)是姜科植物蓬莪術(shù)Curcuma phaeocaulis Valeton、廣西莪術(shù)Curcuma kwangsinensis S.G.Lee et C.F. Liang和溫莪術(shù)Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling的干燥根莖。中醫(yī)理論認為莪術(shù)辛、苦、溫，歸肝、脾經(jīng)，具行氣破血、消積止痛的功效［1］。莪術(shù)揮發(fā)油中的β-欖香烯對腫瘤細胞生長有直接抑制作用［2］。莪術(shù)油能抑制腫瘤細胞異常增殖［3］。 莪術(shù)油的質(zhì)量直接關(guān)系到其制劑的質(zhì)量，由于中藥材的藥效不是來自任何單一的活性成分，任何單一活性成分都不能確切反映中醫(yī)用藥所體現(xiàn)的整體療效，所以采用任何單一活性成分或指標成分都難以準確評價中藥的真?zhèn)魏蛢?yōu)劣。中藥產(chǎn)業(yè)現(xiàn)代化的瓶頸是質(zhì)量不可控、安全不可靠［4］。為加強中藥生產(chǎn)的質(zhì)量管理和臨床用藥的安全，國家藥品監(jiān)督管理局在中藥質(zhì)量標準中引入指紋圖譜技術(shù)要求。色譜技術(shù)測定指紋圖譜具有綜合、宏觀、“模糊”的非線性特點。本研究按照《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求》（暫行）和《中藥注射劑色譜指紋圖譜試驗研究操作規(guī)程指南》（試行）的規(guī)定，首次采用GC-MS對蓬莪術(shù)揮發(fā)性成分建立指紋圖譜。由于不同種、不同產(chǎn)地的莪術(shù)藥材揮發(fā)性成分及含量有較大差異［5］，所建立的中藥指紋圖譜必須固定藥材的種屬和產(chǎn)地，因而選定四川省種植的蓬莪術(shù)Curcuma phaeocaulis Valeton（道地藥材［6］），采用水蒸氣蒸餾法提取蓬莪術(shù)揮發(fā)油，采用GC-MS聯(lián)用技術(shù)測定其指紋圖譜，并且利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件”對不同樣品之間的相似度進行計算，為蓬莪術(shù)藥材的綜合質(zhì)量控制提供參考。

1 器材 HP6890/HP5973 GC/MS 聯(lián)用儀（美國惠普公司）。色譜柱為HP-5MS 5% Phenyl Methyl Siloxane（30 m×0.25 mm×0.25 μm）彈性石英毛細管柱，醋酸乙酯(分析純，上海化學試劑有限公司)。 柱溫60℃，保持1 min，以10℃·min-1升溫至100℃，再以4℃·min-1升溫至200℃后，以20℃·min-1升溫至280℃，保持2 min；汽化室溫度 250℃；載氣為高純He（純度為99.999%）；柱前壓 52.6 kPa，載氣流量1.0 ml·min-1；進樣量 1 μl；分流比40∶1。離子源為EI源；離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；電子能量70 eV；發(fā)射電流34.6 μA；接口溫度280℃；倍增器電壓：1 388V；溶劑延遲4 min；質(zhì)量范圍10～550 amu。 采集10批次四川省種植的蓬莪術(shù)（樣品由四川成都仙森生物科技有限公司提供），經(jīng)本實驗室的嚴志堅博士鑒定為Curcuma phaeocaulis Valeton。

2 方法與結(jié)果

2.1 揮發(fā)油的提取

取蓬莪術(shù)干燥根莖粉碎成粗粉，過0.64 mm篩，稱量80 g，加入1 000 ml燒瓶中，加8倍水量，用揮發(fā)油提取器提取6 h(提取條件經(jīng)正交實驗優(yōu)化)，獲得具有特殊氣味的油狀物，用無水硫酸鈉除去水分放置于冰箱（-18℃）中備用。

2.2 精密度取同一批次樣品，在所建立的測定條件下，連續(xù)進樣5次，實驗結(jié)果得出TIC圖中各色譜峰相對保留時間的RSD在0.29%～1.22%之間，各共有峰的相對峰面積的RSD＜5%，其指紋圖譜的相關(guān)系數(shù)在0.981～0.993之間，符合指紋圖譜研究的技術(shù)要求。

2.3 重復性取同一批蓬莪術(shù)藥材5份，按樣品制備方法制備，并在所建立的測定條件下測定，結(jié)果表明，TIC圖中各共有峰相對保留時間的RSD在0.41%～1.84%之間，各共有峰的相對峰面積的RSD＜5%，其指紋圖譜的相關(guān)系數(shù)在0.962～0.981之間，符合指紋圖譜研究的技術(shù)要求。

2.4 穩(wěn)定性取同一批次樣品，在所建立的測定條件下，分別在0，1，2，4，8，12，24 h進行測定，考察各主要色譜峰相對保留值，結(jié)果表明各共有峰相對保留時間的RSD在0.36%～1.46%之間，各共有峰的相對峰面積的RSD＜5%，其指紋圖譜的相關(guān)系數(shù)在0.971～0.988之間，符合指紋圖譜研究的技術(shù)要求。樣品在冰箱中-18℃保存6個月后按所建立的測定條件測定，譜圖保持不變，表明樣品的穩(wěn)定性好。

2.5 指紋圖譜的建立及分析按所建立的測定條件對10個四川雙流產(chǎn)的蓬莪術(shù)藥材樣品的揮發(fā)性成分進行測定，其典型的GC-MS的色譜指紋圖譜見圖1。有20個主要的共有特征峰（占總峰面積90%以上），選擇9號峰為參照峰，此峰為所有蓬莪術(shù)樣品所共有的，然后分別求出各特征峰的調(diào)整保留時間之比（α值）和相對峰面積（峰面積之比）。結(jié)果見表1。表1 10批次蓬莪術(shù)油特征（峰）成分相對含量（略） 由于采用的測試手段是GC-MS聯(lián)用技術(shù)，通過HP MSD化學工作站檢索Nist98標準質(zhì)譜圖庫和WILEY質(zhì)譜圖庫，并結(jié)合有關(guān)文獻譜圖解析［5～8］，鑒定了16個共有峰。從蓬莪術(shù)揮發(fā)油的質(zhì)譜分析結(jié)果可知，α值為1.00時，組分是莪術(shù)烯（Curzerene）；單峰面積占總峰面積大于20%的共有峰只有1個，就是α值為1.18的組分，質(zhì)譜檢索結(jié)果是莪術(shù)酮（Curzerenone），該面積比值所允許的誤差范圍是4.51～5.77。其余的共有峰面積占總峰面積均小于10%。

2.6 指紋圖譜相似度分析采用國家食品藥品監(jiān)督管理局推薦的“中藥指紋圖譜計算機輔助相似度計算軟件”對測定結(jié)果進行計算，10個批次蓬莪術(shù)藥材（四川產(chǎn)）的相似度分別是0.978，0.957，0.962，0.900，0.905，0.895，0.965，0.900，0.978和0.978。從此結(jié)果可以看出，10批次蓬莪術(shù)揮發(fā)油樣本的相似度均在89%以上，未發(fā)現(xiàn)離群樣本，符合國家食品藥品監(jiān)督管理局對中藥指紋圖譜相似度的要求。

3 小結(jié) 本研究在提取、測試條件等方面經(jīng)過大量的實驗摸索，所建立的GC-MS研究蓬莪術(shù)揮發(fā)油指紋圖譜的方法有良好的精密度、重現(xiàn)性，樣品穩(wěn)定。 GC-MS具有定性功能的優(yōu)點，因而采用GC-MS建立揮發(fā)油指紋圖譜，基本不受色譜柱、不同儀器等條件的限制。即使未鑒定出某些成分，也可根據(jù)其質(zhì)譜“棒形圖”進行辨認。 本研究按照《中藥注射劑色譜指紋圖譜試驗研究操作規(guī)程指南》（試行）的規(guī)定，采用國家食品藥品監(jiān)督管理局推薦的“中藥指紋圖譜計算機輔助相似度計算軟件”進行計算，使所得到的指紋圖譜能全面、綜合和準確地反映蓬莪術(shù)藥材的質(zhì)量情況，為莪術(shù)藥材的質(zhì)量控制提供科學依據(jù)，同時也為莪術(shù)中藥制劑制定指紋圖譜研究奠定基礎(chǔ)。 莪術(shù)的藥用性除了揮發(fā)油以外，還有它的醇提部分等，若能結(jié)合HPLC或LC-MS等多種分析儀器聯(lián)用的模式［9］，將能更好地體現(xiàn)中藥的整體性和復雜性。

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