作者：伍慶，張明時，王興寧，曹桂紅

【摘要】 目的 建立同時測定杜仲藥材中綠原酸和松脂醇二葡萄糖苷含量的高效液相色譜法。方法采用Diamonsil C18柱（5 μm ，250 mm×4.6 mm），以乙腈-水-0.4%磷酸水溶液（15∶85∶0.5）為流動相，檢測波長227 nm。結果樣品中綠原酸和松脂醇二葡萄糖苷的加樣回收率分別為95%～98%，96% ～103%；綠原酸和松脂醇二葡萄糖苷的線性范圍分別為0.298～2.98 μg，r=0.999 9和0.872～8.72 μg ，r=0.999 8。結論貴州不同產地杜仲藥材皮及葉中綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷的含量差異很大。

【關鍵詞】 高效液相色譜法； 杜仲； 綠原酸； 松脂醇二葡萄糖苷

Abstract：ObjectiveTo establish a new HPLC method for simultaneous determination of chlorogenic acid（CGA）and pinoresind diglucoside（PDG）in E.ulmoides Oliv..MethodsCGA and PDG were analyzed by Diamonsil C18 column (5 μm ，250 mm×4.6 mm ) with detector at 227 nm，and the mobile phase consisted of CH3CN-H2O-H2PO3(15∶85∶0.5).ResultsThe recoveries of CGA and PDG were 95%～98%，96%～103% respectively. The linear ranges were 0.298～2.98 μg with a regression coefficient of 0.999 9 for chlorogentic acid and 0.872～8.72 μg with a regression coefficient of 0.999 8 for pinoresind diglucoside. ConclusionQuantitative analysis showed that there was considerable difference for the contents of CGA and PDG in the barks and leaves of E. ulmoides Oliv. From difference growing areas in Guizhou.

Key words：HPLC； Eucommia ulmoides Oliv.； Chlorogenic acid； Pinoresind diglucoside

杜仲屬國家二級保護植物，是杜仲科杜仲屬的落葉喬木，中國特有植物種，系地質史上第四紀冰川運動殘留下來的占生孑遺樹種［1，2］。杜仲具有消炎、補腎降壓、增強人體免疫力、抗疲勞、抗衰老、多種藥理作用，其中，綠原酸（chlorogenic acid，CGA）和松脂醇二葡萄糖苷（pinoresind diglucoside，PDG）為杜仲藥材中重要的活性物質［3，4］。近年來對杜仲藥材的研究多限于杜仲葉活性成分的定量分析，而對杜仲皮中這兩種活性成分定量分析甚少［5］，為了充分合理的開發利用杜仲資源，本文采用高效液相色譜法同時對杜仲皮及葉中的綠原酸和松脂醇二葡萄糖苷進行了定性定量分析。方法簡便、快速、準確，有助于杜仲藥材及產品的質量控制和評價。

1 儀器與試藥

日本島津Shimadzu LC-10ATvp高效液相色譜儀，SPD- 10Avp檢測器，HW-2000 工作站（上海千譜）。

綠原酸對照品（批號753-200311）及松脂醇二葡萄糖苷（由貴州德祥制藥有限公司贈送純度大于99%）對照均購于中國藥品生物制品檢定所；杜仲皮及葉均采自貴州各杜仲藥材基地（經貴陽中醫學院劉傳漢老師鑒定）；乙腈為色譜純，甲醇、磷酸均為分析純；水為二次重蒸水。

2 方法與結果

2 .1 溶液的制備

2.1.1 對照品儲備液

分別精密稱取對照品適量，用60%甲醇溶解后置于25 ml的容量瓶，并稀釋至刻度，配置成含綠原酸1.49 mg·ml-1，松脂醇二葡萄糖苷4.35 mg·ml-1的對照品儲備溶液。

2.1.2 對照品溶液

分別精密吸取對照品儲備溶液1ml，置于10 ml的容量瓶中，用60%甲醇溶解并稀釋至刻度，配置成含綠原酸0.149 mg·ml-1，松脂醇二葡萄糖苷0.435 mg·ml-1的對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液

精密稱取杜仲藥材粉末（過60目篩）2 g，于100 ml錐形瓶中，加入25 ml 60%甲醇溶液，稱定重量，在水浴上回流提取1 h，冷卻后用相應的醇濃度補足重量。經0.45μm的濾膜濾過，續濾液供HPLC分析。

2.2 色譜條件

流動相：色譜柱Diamonsil C18柱（5 μm ，250 mm×4.6 mm），流動相：乙腈-水-0.4%磷酸水溶液（15∶85∶0.5），流速：1ml·min-1，柱溫30℃，檢測波長227 nm。在該色譜條件下，綠原酸和松脂醇二葡萄糖苷分離良好，且不受藥材中雜質的干擾。理論塔板數不小于3 000，見圖1。

2.3 線性關系考察

分別精密吸取對照品溶液依次進樣2，5，10，15，20 μl。按“2.2”色譜條件進行析，以Y為峰面積（uv.s），X為進樣量（μg），綠原酸和松脂醇二葡萄糖苷的回歸方程分別為：Y=267 175X+1 288.1，r=0.999 9，Y=188 306X+280.73，r=0.999 8。 結果表明綠原酸和松脂醇二葡萄糖苷分別在 0.298～2.98，0.872～8.72 μg間呈良好的線性關系。

2.4 精密度實驗對同一份杜仲樣品平行測定5次，綠原酸和松脂醇二葡萄糖苷的RSD分別為：0.23% ，1.5%，n=5。

2.5 重復性實驗精密稱同一份杜仲樣品5份，按“2.2”方法制備供試品溶液，在“2.2”色譜條件下分別測定，綠原酸和松脂醇二葡萄糖苷的RSD分別為：0.76%，0.69%，n=5。

2.6 回收率實驗精密稱取已測含量的杜仲藥材粉末6份，每份2 g，按樣品含綠原酸及松脂醇二葡萄糖苷的80%，100%，120%精密加入綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷對照品儲備溶液，按“2.1.2”的方法制備供試溶液，進樣量10 μl。結果綠原酸及松脂醇二葡萄糖苷的回收率分別為95%～98%，96% ～103%；精密度RSD分別為0.8%～1.7%，1.5%～2.7%，n=3。結果見表1。表1 回收率實驗結果（略）

2.7 供試品溶液穩定性實驗取同一供試品溶液，分別在0，2，4，6，8，10，12h測定，綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷含量的RSD分 別為1.7%，2.2% ，n=7 ，表明供試品溶液在12 h內穩定。2.8 樣品的測定 分別取貴州不同產地的杜仲藥材按“2.1.2”方法制備供試品溶液、按“2.2”的色譜條件進行含量測定，結果見表2。實驗結果表明，貴州不同產地的杜仲皮及葉中的綠原酸和松脂醇二葡萄糖苷的含量差異很大，杜仲葉中只含有綠原酸，未檢出松脂醇二葡萄糖苷；且同一株杜仲藥材皮及葉中的綠原酸含量有一定倍數關系；皮中的綠原酸和松脂醇二葡萄糖苷的含量無確定關系。因此，簡單的一個指標不足以對杜仲藥材質量進行評價。表2 杜仲藥材含量測定結果（略）

3 討論

3.1 提取溶劑的選擇 綠原酸和松脂醇二葡萄糖苷屬于芳香族化合物，易溶于水及強極的溶劑中，本文選擇甲醇-水、乙醇-水和水3種溶劑作為提取溶劑，結果表明，以60%的甲醇作為提取溶劑時，綠原酸和松脂醇二葡萄糖苷提取較完全。

3.2 提取方法的選擇本實驗考慮了超聲、回流、索氏提取3種提取方法，發現回流提取效率明顯高于其他兩種提取方法；實驗中通過比較了提取溫度、料液比、提取時間對提取率的影響。結果以回流法提取、提取溫度80℃，料液比0.08，提取時間1h提取效果最佳。

3.3 檢測波長的選擇綠原酸和松脂醇二葡萄糖苷的對照品溶液的紫外分析表明，綠原酸在220，246，232 nm，松脂醇二葡萄糖苷在227，280，288 nm有較強吸收，對各波長進行比較，發現在227 nm處兩組分都具有較好的靈敏度，應此，選擇227 nm為檢測波長。

【參考文獻】 ［1］牛春山.陜西樹木志［M］.北京:中國林業出版社，1940：128. ［2］任憲威.樹木學［M］.北京：中國林業出版社，1997：362. ［3］李芳東，杜洪巖.杜仲［M］.北京：中國中醫藥出版社，2001：277.