作者：王新華金東嶺何紅梅張延霞時志民趙如同

【摘要】 目的探討黃芩苷對抗結核藥物肝損傷的保護作用機制。方法將60只小鼠完全隨機分為6組，即正常對照組，肝損傷 (異煙肼+利福霉素鈉) 組，聯苯雙酯組及黃芩苷高、中、低劑量組。給藥8 d后，分別用光鏡和電鏡觀察肝臟組織細胞病理學的改變情況，用免疫組織化學染色技術分析腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的表達情況。結果黃芩苷能明顯減輕肝細胞變性和壞死，炎癥活動程度明顯減輕（P<0.05 或P<0.01 ）；TNF-α蛋白在黃芩苷組小鼠肝臟組織內為弱陽性表達（P<0.05 或P<0.01 ）；黃芩苷3個劑量組間小鼠肝臟病理形態學及肝臟組織內TNF-α蛋白的表達均無顯著性差異（P>0.05）。結論黃芩苷對抗結核藥物肝損傷的保護作用可能與抑制TNF-α蛋白表達有關。

【關鍵詞】 黃芩苷；抗結核藥物；肝損傷；腫瘤壞死因子-α；免疫組織化學

Abstract：Objective To investigate the protective effects of baicalin on the hepatic injury induced by antituberculosis drugs in mice. MethodsSixty mice were pided randomly into 6 groups: normal control group， liver injury isoniazid and rifamycin sodium group， positive control group， baicalin groups(high， middle and low doses ). The drugs were administered to mice once daily for 8 days. Light microscope and electronic microscope were used respectively to observe the histopathological changes of the hepatic cells. The expression of tumor necrosis factor-α (TNF-α) was detected by immunohistochemistry. ResultsBaicalin alleviated the degeneration and necrosis induced by antituberculosis drugs obviously. The level of inflammatory activity was relieved significantly (P<0.05， P<0.01). The immunoreactivity of TNF-α protein in liver cells was slightly stained in baicalin groups (P<0.05， P<0.01). There were no significant differences about the pathomorphology， the inflammatory activity and the express of TNF-α protein among baicalin groups (P>0.05). ConclusionThe protective effects of baicalin on hepatic injury induced by antituberculosis drugs may be related to inhibit TNF-α protein expression.

Key words：Baica1in; Antituberculosis drugs; Hepatic injury; Tumor Necrosis Factor-α; Immunohistochemistry 結核病患者在化療過程中遇到的最棘手問題之一是應用的抗結核藥物對肝臟的損害［1～3］，它可導致化療中止，甚至危及患者的生命。本實驗前期研究已證實黃芩苷對異煙肼和利福霉素鈉所致肝損傷具有較好的保護作用［4］，但是這種保護作用機制還不清楚。本實驗試圖通過免疫組織化學技術及病理形態學超微結構觀察探究黃芩苷對抗結核藥物致小鼠肝損傷的保護作用機制。

1 材料

1.1 藥物與試劑

黃芩苷（承德頸復康藥業集團霧靈藥業有限責任公司，批號：050920）；異煙肼注射液（天津金耀氨基酸有限公司，批號：0505101）；利福霉素鈉注射液（沈陽雙鼎制藥有限公司，批號：05080802）；聯苯雙酯滴丸（德州德藥制藥有限公司，批號：050501）；兔抗小鼠TNF-α單克隆抗體和即用型SABC試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司， 編號：SA2041）。

1.2 動物健康

清潔級KM小鼠60只，♀♂兼用，體重18～22 g，由河北醫科大學實驗動物中心提供。

2 方法

2.1 動物分組及處理

將60只小鼠完全隨機分為6組，每組10只，即正常對照組，肝損傷（利福霉素鈉+異煙肼）組，聯苯雙酯組和黃芩苷高、中、低3個劑量組。正常對照組灌胃給予0.9%氯化鈉注射液0.2 ml·(10 g)-1·d-1，共8 d；肝損傷組腹腔注射0.25%利福霉素鈉0.2 ml·(10 g)-1·d-1和灌胃給予0.3%異煙肼 0.2 ml·(10 g)-1·d-1，共8 d；聯苯雙酯組在給予利福霉素鈉和異煙肼(劑量及給藥方式同肝損傷組)1 h后灌胃給予1.0%聯苯雙酯0.2 ml·（10 g）-1·d-1，共8d；黃芩苷分3個劑量組，在給予利福霉素鈉和異煙肼(劑量及給藥方式同肝損傷組)1 h后分別灌胃給予不同濃度(即1.0%，0.5%和0.25%)黃芩苷0.2 ml·（10 g）-1·d-1，共8 d。全部動物末次給藥后禁食16 h。第9天將小鼠拉頸椎脫臼致死，立即剖開腹腔取出肝臟。

2.2 肝臟組織病理形態學觀察

取上述小鼠肝臟右葉部分，以10%中性福爾馬林固定，常規石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察肝臟組織病理學變化。炎癥活動度計分標準參照王泰齡等［5］提出的慢性肝炎炎癥活動度計分方法，分為匯管區炎癥（P）、小葉內炎癥（L）、碎屑壞死（PN）及橋接壞死（BN，包括分小葉壞死）4項，每項依病變程度分別計為1，2，3，4分，因為PN、BN的嚴重程度與預后直接相關，因而計分2倍于其他病變，計分公式為：P+ L+2×（PN+BN）。

2.3 肝臟組織TNF-α蛋白免疫組化檢測

免疫組織化學染色按SABC試劑盒說明書進行。一抗為兔抗小鼠TNF-α。玻片經多聚賴氨酸防脫片處理，小鼠肝組織切片用0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6.0）進行微波抗原修復，其余步驟按試劑盒說明書進行。DAB顯色，蘇木精復染，中性樹脂封片。以PBS代替一抗做陰性對照。免疫組織化學染色結果用病理圖像分析系統分析TNF-α表達情況并測量其灰度值。

2.4 肝臟組織透射電鏡觀察

取肝組織塊切成約1 mm×1 mm×1 mm 后，用2.5%戊二醛前固定，1%鋨酸后固定，漂洗，逐級脫水、浸透、固化，制成超薄切片后，在日立H-7500 透射電鏡下觀察肝臟細胞的超微結構變化。

2.5 統計學方法

數據均以±s表示。組間顯著性檢驗采用unpaired t test，多組與對照組的兩兩比較用Dunnett t檢驗。統計學分析使用InStat-3軟件。

3 結果

3.1 HE染色肝臟組織病理觀察

正常對照組小鼠肝小葉結構清楚，肝細胞索排列整齊，肝細胞形態正常，核結構清晰，肝竇正常。肝損傷組小鼠肝細胞彌漫性水腫，胞漿疏松化和氣球樣變，肝細胞碎片狀壞死，散在有肝細胞凋亡。黃芩苷高中低3個劑量組小鼠的肝小葉結構清楚，肝細胞基本正常，核結構清晰，少數肝細胞輕度水腫，并且有肝細胞再生現象。聯苯雙酯組小鼠肝細胞彌漫性輕度水腫，有肝細胞點狀壞死。黃芩苷3個劑量組間小鼠肝臟病理形態學無明顯差別，并且與聯苯雙酯組間病理形態學比較亦無差別。與正常對照組比較，肝損傷組小鼠肝臟組織炎癥活動度計分升高有顯著性（P<0.01）；與肝損傷組比較，黃芩苷3個劑量組和聯苯雙酯組小鼠肝臟組織炎癥活動度計分降低有顯著性（P<0.05，P<0.01）；但黃芩苷3個劑量組間小鼠肝臟組織炎癥活動度計分無顯著性差異（P>0.05），并且與聯苯雙酯組間比較亦無顯著性差異（P>0.05）。炎癥活動度計分情況見表1。表1 各組小鼠炎癥活動度計分情況的比較(略)

3.2 肝臟組織TNF-α免疫組化染色結果

正常對照組小鼠肝臟組織內TNF-α蛋白無表達；聯苯雙酯組和黃芩苷3個劑量組小鼠肝臟組織內TNF-α蛋白均主要表達于中央靜脈周圍的少數肝細胞，表達強度為弱陽性（±～ +）；肝損傷組TNF-α蛋白在絕大多數小鼠肝細胞內均有強陽性表達（+++），包括中央靜脈周圍的肝細胞和匯管區附近肝細胞，陽性物質主要分布在胞質和胞核。與正常對照組比較，肝損傷組小鼠肝臟組織中TNF-α蛋白表達升高有顯著性（P<0.01）；與肝損傷組比較，黃芩苷3個劑量組和聯苯雙酯組小鼠肝臟組織中TNF-α蛋白表達降低有顯著性（P<0.05或P<0.01）；但黃芩苷3個劑量組間小鼠肝臟組織中TNF-α蛋白表達無顯著性差異（P>0.05），并且與聯苯雙酯組間比較亦無顯著性差異（P>0.05）。TNF-α 在各組小鼠肝臟組織中表達情況見表2。表2 TNF-α 在各組小鼠肝臟組織中表達情況的比較（略）

3.3 肝細胞超微結構改變

正常對照組小鼠肝細胞形態、線粒體、粗面內質網均正常。肝損傷組小鼠肝細胞內線粒體空泡化，嵴膜融合、消失，髓樣變性，粗面內質網脫顆粒，糖原數量顯著減少。黃芩苷3個劑量組小鼠肝細胞結構均基本正常，僅個別線粒體輕度水腫、嵴融合、粗面內質網有脫顆粒現象。聯苯雙酯組肝細胞有部分線粒體變性，嵴膜融合，糖原數量減少，粗面內質網脫顆粒，細胞質水腫。

4 討論

近年來的研究表明［6，7］，各種急、慢性肝病的發病過程均與肝細胞的異常凋亡有關。在病毒性肝炎患者的肝組織中肝細胞凋亡與壞死同時存在，患者體內還有TNF-α等多種細胞因子水平的升高，細胞因子水平的升高又加重了肝損害。TNF-α可通過誘導肝細胞凋亡參與肝臟疾病的發病過程，TNF-α是肝壞死發生中的一種重要的細胞因子，TNF-α被認為是介導肝損傷的主要和終末介質，且與肝損傷程度呈明顯正相關，TNF-α水平越高，肝病越重［8］。研究還發現，內毒素血癥時，內源性TNF-α增加，肝細胞膜上TNF-α受體表達也明顯上調［9，10］ ，說明TNF-α/TNF-α受體途徑在內毒素血癥肝細胞凋亡中發揮一定作用，TNF-α通過其受體，導致肝細胞凋亡，引起炎癥細胞浸潤和肝組織壞死。而抗結核藥物所致肝損害的病理變化與慢性乙型肝炎比較，本質上無明顯差別［1］，推測異煙肼和利福霉素鈉的肝損傷是否也有肝細胞凋亡機制的參與。因此，從肝細胞凋亡的角度探討黃芩苷對異煙肼和利福霉素鈉所致小鼠肝損傷的保護作用機制意義重大。 黃芩苷是中藥黃芩中的主要成分，它具有黃芩的基本作用，并體現出其更顯著的抗氧化、抗病毒、調節免疫、解熱、抗感染等藥理作用。肝組織損傷與病毒感染、炎癥、過氧化反應、自身免疫系統失衡等息息相關。實驗研究已證實，黃芩苷對化學和免疫實驗性肝損傷均有一定的保護作用，這與它具有顯著的抗氧化、免疫調節以及清除自由基作用有關［11，12］。本實驗的前期研究亦表明，黃芩苷高、中、低3個劑量組均能顯著降低由異煙肼和利福霉素鈉所致的小鼠血清ALT和AST活性的升高，并使肝損傷小鼠的肝指數降低，具有較好的肝臟保護作用［4］。體外研究已表明，不同濃度的黃芩苷均對TNF-α所誘導的體外培養大鼠肝細胞凋亡有抑制作用［13］。本次實驗研究顯示，黃芩苷3個劑量組小鼠肝細胞的變性和壞死程度較肝損傷組均明顯減輕，炎癥活動程度明顯減輕（P<0.05 或P<0.001 ），肝細胞超微結構較肝損傷組有明顯改善，且TNF-α蛋白為弱陽性表達，而肝損傷組TNF-α蛋白在絕大多數小鼠肝細胞內均有強陽性表達。其研究結果說明，異煙肼和利福霉素鈉的肝損傷作用機制可能與TNF-α蛋白在肝臟組織細胞的高表達有關，TNF-α在異煙肼和利福霉素鈉所致小鼠肝損傷過程中起著重要作用，黃芩苷可能通過抑制TNF-α蛋白的表達，從而減輕肝細胞的凋亡與壞死。

本實驗已為更深入研究抗結核藥物致肝損傷的發病機制以及黃芩苷對其肝損傷的保護作用機制提供了新的方向。古今中醫學者都把黃芩作為除肝膽濕熱的一味中藥，故有必要進一步開展黃芩苷對肝細胞膜、肝細胞器等保護作用機制的研究。

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