作者：鄭倩 劉紅 曹弟勇 劉華 藍海濤 敬華娥

【摘要】 目的通過白細胞介素1β（Interleukin-1β，IL-1β）損傷離體胰島細胞，研究蟲草菌絲( Cordyceps sinensis， CS)含藥血清對胰島細胞的保護作用以及其機制與抗氧化酶和一氧化氮（Nitric oxide ，NO）的關系。方法離體培養乳鼠胰島細胞，用IL-1β損傷胰島細胞，與不同濃度CS含藥血清共同孵育，應用MTT法檢測細胞活性，放免法檢測基礎和高糖胰島素分泌量，比色法檢測細胞培養上清液中一氧化氮（NO）的含量，誘生型一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase ，iNOS）、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase ，SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione perioxidase，GSH-Px）的活性。結果CS含藥血清顯著提高IL-1β損傷的胰島細胞活性，并且胰島細胞基礎和高糖刺激胰島素分泌量明顯提高。IL-1β作用后細胞培養上清液中NOS活性升高，NO含量增加，而SOD，GSH-Px的活性水平降低，經與不同濃度CS含藥血清共同孵育后，細胞培養上清液中NO含量減少、iNOS活性降低，SOD，GSH-Px的水平明顯升高，呈劑量依賴性，具有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。結論CS含藥血清對IL-1β損傷的胰島細胞分泌功能和細胞活性有保護作用，其機制與降低iNOS的活性，從而減少NO生成以及提高SOD，GSH-PX的活性水平有關。

【關鍵詞】 蟲草菌絲 血清藥理學 胰島 細胞損傷 細胞保護

Abstract：ObjectiveTo investigate the effects and mechanism of medicated sera of cs on the islet cell damage induced by IL-1β.MethodsThe pancreases of the rats were removed to collect islet cells ，and then the cells were pided into normal control group， IL-1β damadaged group， IL-1β+medicated sera of cs groups.The cellular activity was detected with methyl-thiazol-tetrazolium(MTT) assay，basic amount of insulin secretion and stimulated by high glucose was detected by radioimmunoassay，the content of nitric oxide and activities of nitric oxide synthase superoxide dismutase and glutathione perioxidase were determued according to the kit direction.ResultsMedicated sera of cs obviously improved the islet cellular activity damaged by IL-1β，and basic amount of insulin secretion and stimulated by high glucose were improved（P＜0.01）. content of nitric oxide and activity of nitric oxide synthase in the supernatant were obviously higher in IL-1β damaged group，and there were significant differences between the medicated sera of cs groups and IL-1β damaged group. Compared with IL-1β damage group， medicated sera of cs could significantly elevate the activities of superoxide dismutase and glutathione perioxidase（P＜0.05 ，P＜0.01）.ConclusionMedicated sera of cs plays a protective role in the pancreatic islets damaged by IL-1β.The protective mechanism may be correlated with the decrease of iNOS activity and the content of nitric oxide，and the increase of the activities of superoxide dismutase and glutathione perioxidase.

Key wordsCordyceps sinensis； Seropharmacology； Islets of langerhans； Cytoprotction； Cell trauma 1型糖尿病是一種胰島β細胞選擇性破壞的自身免疫性疾病，其病理表現為大量免疫炎性細胞浸潤胰島，并分泌白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子(TNF)和干擾素-γ(IFN-γ)等細胞因子，其中IL-1β可能是其重要的內源性損傷因子［1］。近年來中草藥對糖尿病的防治作用受到了廣泛關注。冬蟲夏草是一種名貴強壯滋補中藥，為麥角菌科真菌冬蟲夏草寄生在蝙蝠蛾科昆蟲上的子座及其幼蟲尸體的復合體。其味甘、性溫，歸肺、腎經，有補虛填精、保肺益腎、止血化痰等作用，現代藥理學證明其有抗氧化、調節免疫、抗腫瘤、抑菌、抗病毒的作用。但由于天然蟲草有嚴格的寄生性和特殊的生長地理環境，藥缺價高，限制天然蟲草的使用。人工蟲草是人工發酵培養得到的菌絲，其成分和藥理作用與天然蟲草基本一致，因此對蟲草菌絲的實驗研究和臨床應用逐步深入，有報道認為蟲草菌絲可以降低血糖的濃度［2］，以及提高肝纖維化大鼠的胰島細胞基礎胰島分泌量［3］，但其具體機制并不清楚，缺乏相關的基礎研究。目前有報道認為胰島抗氧化系統活性降低與一氧化氮（NO）水平提高是糖尿病早期病變之一，NO和氧自由基可破壞胰島細胞，引起1型糖尿病。本實驗室用IL-1β損傷乳鼠胰島細胞，觀察IL-1β對胰島抗氧化系統活性與NO 水平的影響，采用血清藥理的方法探討蟲草菌絲對IL-1β損傷的離體胰島細胞的活性和分泌功能是否具有保護作用以及其機制與抗氧化作用和NO的關系。

1 器材

1.1 材料出生1~3 d的Wistar大鼠 和體重200～220 g的健康Wistar大鼠均由川北醫學院實驗動物中心提供；RPMI-1640培養液為美國GIBCO公司產品；IL-1β、胎牛血清為天津灝洋生物科技有限責任公司產品；蟲草菌絲購自中美華東醫藥制藥公司(批號061140)；胰島素放免檢測試劑盒為華西生物制劑公司產品；膠原酶V型、STZ均為美國Sigma公司產品；SOD，GSH-Px，NO，NOS 測定盒由南京建成生物工程研究所提供；其他試劑為國產分析純。

1.2 儀器CO2孵育箱（Forma scientific，美國），超凈工作臺（SW-CJ-2FD，蘇州安泰），倒置相差顯微鏡（olympus，日本），全自動酶標儀（BIO-RAD，2550型，美國），紫外分光儀（RF-540，日本島津），臺式冷凍高速離心機（日立himac CF-15型，日本），高壓蒸氣滅菌器（YXQ-SG46，上海博訊有限公司醫療設備廠）。

2 方法

2.1 藥物血清的制備 ① 選用Wistar大鼠40只，體重200~220 g，雌雄各半。灌胃前禁食12 h，設立正常對照組和用藥組，用藥組給予蟲草菌絲灌胃，每次10 ml/ kg，分低、中、高3個劑量組（1，10，20 g/kg），分別相當于70 kg成人用量的5，10，20倍，正常對照組給予等容量生理鹽水灌胃，所取血清為生理鹽水對照血清 ，作對照用。② 使用二次加強給藥法給藥（首次給藥2 h后，再次予相同的劑量灌胃），在第2次給藥后第1，2，3 h，于無菌條件下自心臟采血，靜置4 h以上，離心30 min(3 000 r/min，4℃)，分離血清，56℃ ，滅活30 min，置-70℃ 低溫冰箱冷藏備用，1 個月內使用。

2.2 胰島細胞分離與培養出生1~3 d的Wistar大鼠20只，無菌取出胰腺，清洗，剪碎，V型膠原酶消化，HankS液終止消化，消化離心。加入10%胎牛血清的RPMI-1640培養液，制成細胞懸液，37℃，5%CO2孵育箱內培養24 h后，去除成纖維細胞，收集胰島細胞，制成新的細胞懸液，調節細胞濃度至1×106 ml，置96孔板培養，每孔內加入細胞懸液200 μl。隨機分組。分為正常對照組、IL-1β損傷組、IL-1β+不同濃度CS含藥血清保護組（IL-Iβ+CS1為低劑量含藥血清組，IL-1β+CS2為中劑量含藥血清組，IL-1β+CS3為高劑量含藥血清組），每組平行孔6孔，損傷組和保護組每孔細胞加100 u/ml IL-Iβ 20 μl作用20 h后，正常對照組加入大鼠生理鹽水對照組血清20 μl，于不同保護組分別加入20 μl 低、中和高劑量含藥血清CS繼續培養30 h，進行各項檢測。

2.3 四唑藍比色法（MTT法）檢測細胞活性檢測方法如下：將各組細胞離心（500 r/min×5 min），吸取細胞培養上清液，于細胞中加200 μl的培養液（不含胎牛血清）和5mg/ml的MTT 20 μl，放入CO2孵育箱培養4 h后，再離心（1 000 r/min×10 min），棄上清，加入二甲亞楓200 μl，振蕩5 min，在全自動酶標儀上比色，測出每孔光密度值（OD值）進行比較，檢測波長為600 nm，OD值越高表明細胞活性就越強。

2.4 胰島細胞上清液胰島素分泌量測定提取正常對照組、IL-1β損傷組和IL-1β+CS組各待測標本細胞培養上清液，用放免法檢測胰島素的基礎分泌量；在抽取上清液的各組細胞中加入含20 mmol/L的葡萄糖培養液繼續培養2 h，離心提取上清液，按上述方法進行高糖刺激胰島素分泌量檢測。

2.5 細胞培養液NO水平，iNOS，SOD和GSH-Px活性的檢測提取正常對照組、IL-1β損傷組和IL-1β+CS組各待測標本細胞培養上清液，分別用試劑盒進行檢測，步驟嚴格按試劑盒說明進行。

2.6 統計學處理實驗結果以±s表示，α=0.05，采用方差分析。整個統計資料采用SAS軟件處理完成。

3 結果

3.1 CS藥物血清對IL-1β損傷胰島細胞活性影響表1結果表明IL-1β損傷組與正常對照組比較光密度值OD值降低，表明細胞活性明顯下降（P＜0.01）；損傷后加入不同濃度CS藥物血清共同孵育可使OD值較損傷組均有不同程度的提高，具有顯著意義，且具有劑量依賴性。

表1 不同濃度CS藥物血清對IL-1β損傷細胞活性的影響（略）

與空白組比較，﹡﹡P＜0.01；與IL-1β損傷組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；n=6

3.2 細胞培養液胰島素分泌量測定結果見表2。加入IL-1β作用后胰島細胞基礎分泌胰島素量和葡萄糖刺激分泌量顯著下降（P＜0.01），在損傷的基礎上與不同濃度CS藥物血清共同培養30 h后，測試培養液中分泌量和葡萄糖刺激胰島素分泌量較損傷組有明顯升高，具有統計學意義。

表2 細胞培養液基礎胰島素分泌量和葡萄糖刺激胰島素分泌量（略）

與正常對照組比較，﹡﹡P＜0.01; 與IL-1β損傷組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；n=6

3.3 細胞培養液中 SOD，GSH-Px水平的測定與IL-1β作用后胰島細胞培養液中SOD活性顯著降低（P＜0.01），GSH-Px活性減弱（P＜0.01），在損傷的基礎上與不同濃度CS藥物血清共同培養30 h后，測試培養液中SOD以及GSH-Px的活性升高，具有統計學意義。見表3。

3.4 細胞培養液中NO含量和iNOS活性的檢測加入IL-1β后，與正常對照組比較可見胰島細胞培養液中iNOS的活性與NO含量顯著增加（P＜0.01），經與不同濃度CS藥物血清共同培養30 h后，測試培養液中iNOS的活性降低，NO 的含量減少，具有統計學意義。見表4。

表3 細胞培養液SOD和GSH-PX活性（略）

與正常對照組比較，﹡﹡P＜0.01；與IL-1β損傷組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01;n=6

表4 細胞培養液NO含量和iNOS活性（略）

與正常對照組比較，﹡﹡P＜0.01；與IL-1β損傷組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；n=6 4 討論 血清藥理學研究是指給動物灌胃或人服用一定量的中藥或復方制劑，在一定時間后采集血液，分離血清，以此進行體外試驗的一種實驗方法。此方法由20世紀中期日本學者Iwama H等提出。與傳統的將中藥粗提物直接加入反應體系中的方法相比，它具有明顯的優勢：在某種程度上克服了中藥本身的雜質對試驗結果的影響，而且相對接近于藥物在體內生物轉化的真實過程，能客觀地闡明中藥藥效和作用機理，且使中藥藥理的研究易于深入到細胞分子水平。近20 年來，其已成為中藥藥理研究的一個熱點，在體外實驗中得到了廣泛的應用，是目前研究中藥藥理學的一種較為理想的方法［4］。本研究采用血清藥理方法探討CS對IL-1β損傷胰島細胞的保護作用和機制，實驗中多次給藥可使血清藥物濃度出現累加效應，二次重復給藥提高了血清藥物濃度，所采集的血清經56℃ ，滅活30 min處理后，避免了未滅活血清中某些物質對細胞產生毒性和不良反應。 本實驗表明IL-1β對胰島細胞具有損傷作用，表現在100 u/ml的IL-1β使胰島細胞活性減弱，并且可抑制胰島分泌功能，使胰島素基礎分泌量和葡萄糖刺激胰島素的分泌量均減少，這與 Ohara-Imaizumi M［5］報道IL-1β可抑制胰島β細胞活性以及胰島素釋放等生物作用相似。經與含CS含藥血清作用后，能反轉 IL-1β 損傷的離體胰島細胞的活性，細胞活性與未加保護劑的損傷組比較均有顯著提高；并且能減輕IL-1β 損傷的胰島素分泌和葡萄糖刺激的胰島素分泌，使胰島分泌功能增強。 有報道認為，細胞因子對胰島細胞的損傷與NO生成增多和SOD，GSH-Px表達異常有關［6］。本實驗亦證明IL-1β作用后胰島細胞SOD，GSH-Px活力明顯降低， SOD是機體內清除氧自由基的重要抗氧化酶之一，對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用，此酶能清除超氧陰離子自由基（O-2·）保護細胞免受損傷，其活力的高低間接反映了機體清除氧自由基的能力。GSH-Px是機體內廣泛存在的一種重要的催化過氧化氫分解的酶。它特異的催化還原型谷胱甘肽（GSH）對過氧化氫的還原反應，可以起到保護細胞膜結構和功能完整的作用。自由基增多可對細胞、組織造成廣泛損害，自由基可通過丙二醛等醛類的促交聯特點失活蛋白質；可以破壞細胞內一些重要的酶類以及和β細胞膜上的多不飽和脂肪酸反應，降低胞膜流動性，增加通透性，導致線粒體腫脹、DNA斷鏈、降解，直接導致胰島β細胞損傷。 Robertson RP［7］認為胰島細胞內抗氧化酶的含量和活性較低，極易受到氧自由基的損害，對抗氧自由基損傷可以提高胰島細胞的功能，是治療糖尿病的有效途徑之一。 本實驗中證實CS含藥血清反轉IL-1β損傷胰島細胞SOD，GSH-Px活性，可通過增強抗氧化酶的作用，提高清除體內產生自由基的能力，從而減輕自由基的損傷，保護胰島細胞。CS其抗氧化作用可能與主要有效成分蟲草素有關，蟲草素含腺苷、腺嘌呤、尿嘌呤以及18種氨基酸等。 NO可能是IL-1β介導胰島細胞損傷的另一效應因子，有人認為NO可能是通過降低線粒體內烏頭酸酶的活性和抑制電子傳遞系的功能使細胞內ATP生成減少以及DNA斷裂等因素，最終導致胰島細胞的損傷。體內的NO是L-精氨酸在NOS催化下生成的，現在已經鑒定出胰島細胞內至少存在兩種NO合酶，一種是結構性一氧化氮合酶（cNOS），另一種是有誘生性一氧化氮合酶（iNOS），cNOS釋放較低水平的NO，其作用介導不同的生理效應，而在細胞因子介導下，iNOS表達產生大量的NO，導致胰島細胞的損傷。本實驗結果顯示，IL-1β組細胞培養上清液中iNOS活性明顯升高，正是由于其活性的增強，從而使NO生成量增加，經NO的細胞毒性造成胰島細胞的損傷。CS含藥血清與IL-1β損傷細胞共同孵育后，胰島細胞培養上清液中iNOS活性降低，NO的生成減少，結果提示CS可通過降低iNOS的活性而抑制NO的生成，減輕NO的毒性作用，從而保護胰島細胞。 本實驗表明CS藥物血清對胰島細胞具有保護作用，其機制與增強SOD和GSH-Px的活性以及降低iNOS的活性，減少NO的生成有關，本研究為尋找1型糖尿病的中藥治療打下了理論基礎，同時為1型糖尿病的治療提供新的思路與臨床用藥篩選。我國的中醫藥要走向世界需廣大科研工作者對中藥藥理機制進行全面而深入的研究。由于中藥含藥血清的制備過程中受到動物選擇、給藥劑量、采血時間以及含藥血清的滅活、除菌、保存等諸多因素的影響，血清中所含的確切藥效成分尚未十分明了，其方法在技術上尚需探討、規范和完善，因此研究CS中藥血清對體外胰島細胞的藥理作用還有待多方面驗證。 致謝：本院藥物研究所張翔老師和袁彬老師給予了極大的支持與幫助，特此致謝！

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