作者：唐正龍， 王興，伊彪， 李自力， 梁成

【摘要】 目的： 研究云南白藥對血小板顆粒內(nèi)容物釋放和代謝反應(yīng)的影響，探討其止血和抗炎機理。方法： 87例正頜外科手術(shù)患者隨機分為試驗組(43例)和對照組(44例)，分別在術(shù)前3日口服云南白藥膠囊和安慰劑膠囊；采集術(shù)前和術(shù)中靜脈血，用酶聯(lián)免疫吸附法測定手術(shù)開始前和術(shù)中血漿11-去氫-血栓烷B2 (11DehydroThromboxane B2， 11DHTXB2)水平；分離和固定血小板，觀察血小板超微結(jié)構(gòu)和顆粒內(nèi)容物的改變。結(jié)果： 術(shù)前實驗組血漿11DHTXB2（58.83±15.89）ng/L，對照組(69.54±14.43)ng/L，兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；術(shù)中實驗組11DHTXB2(90.41±38.97)ng/L，對照組(131.78±78.92)ng/L，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義；實驗組術(shù)中血小板內(nèi)α-顆粒數(shù)目減少，兩組比較具有統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)論： 云南白藥抑制血小板11DHTXB2的生成，反映了血栓烷A2生成減少，不會增加手術(shù)區(qū)域微血管的收縮，可能有利于改善術(shù)后局部血液循環(huán);在手術(shù)刺激誘導(dǎo)下云南白藥可促進血小板顆粒內(nèi)容物的釋放，有利于提高術(shù)中凝血功能，減少手術(shù)中出血量。

【關(guān)鍵詞】 云南白藥；血小板活化；血小板聚集；細(xì)胞結(jié)構(gòu)

［Abstract］Objective: To observe the changes of platelet release and metabolic reaction after administration of Yunnan Baiyao in orthognathic surgery and to investigate the haemostasis and antiinflammation mechanisms of Yunnan Baiyao. Methods: Eightyseven patients scheduled for bimaxillary orthognathic surgery were enrolled in the prospective， randomized clinical study. Patients were orally administrated with Yunnan Baiyao capsules (group YB， n=43) or placebo capsules (group C， n=44) 3 days before operation. Plasma levels of 11DehydroThromboxane B2 （11DHTXB2） were determined using ELISA pre and intraoperation. The intraoperative ultrastructural aspects and the αgranules number of blood platelets were also observed with electromicroscope. Results: The preoperative plasma level of 11DHTXB2 in group YB (58.83±15.89 pg/ml) was lower than that of group C (69.54±14.43pg/ml)， but the difference was not significant. The intraoperative plasma level of 11DHTXB2 in group YB was significantly lower than that in group C (90.41±38.97 pg/ml vs. 131.78±78.92 pg/ml). The intraoperative average number of αgranule in group YB was also significantly lower than that in group C. Conclusion: The administration of Yunnan Biayao capsules inhibits the metabolic production of blood platelet 11DHTXB2 reflecting the decrease of thromboxan A2 which does not increase the microvascular shrink in operation area， but would improve the local postoperation blood circulation.Yunnan Baiyao Capsules can promote the release of platelet αgranule after the stimulation of operation which benefits the rise of blood clotting.

［Key words］ YUN NAN BAI YAO; platelet activation; platelet aggregation; cellular structures 臨床研究顯示云南白藥具有止血、抗炎和消腫作用[1～3]，但其止血和抗炎作用機理尚不清楚。血小板膜磷脂代謝和顆粒內(nèi)容物的釋放在凝血和其它功能作用中起重要作用，本研究觀察口服云南白藥膠囊后血小板超微結(jié)構(gòu)改變，并檢測11-去氫-血栓烷B2（11DehydroThromboxane B2， 11DHTXB2）水平變化，探討云南白藥膠囊對血小板釋放和代謝反應(yīng)的影響及機理。

1 對象和方法

1.1 對象 病例來自2006年7月～2007年8月在北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面外科就診的牙頜面畸形患者，術(shù)式為Le FortⅠ型截骨術(shù)和雙側(cè)下頜升支矢狀劈開截骨術(shù)，患者年齡18～35歲，無全身系統(tǒng)性疾病及凝血功能異常，患者入選前均簽署了知情同意書。受試者根據(jù)數(shù)字表隨機分為實驗組和對照組，分別于術(shù)前口服云南白藥膠囊和安慰劑膠囊。術(shù)前連續(xù)口服3天試驗藥物，每次2粒（0.5 g），每日4次(共2.0 g)，試驗藥物由云南白藥集團股份有限公司提供。兩組受試者性別構(gòu)成、年齡、體重、身高和凝血功能等術(shù)前指標(biāo)比較無統(tǒng)計學(xué)差異（表1）。表1 兩組患者術(shù)前和術(shù)中基本資料比較（略）注：PT為凝血酶原時間，APTT為活化部分凝血酶原時間。

1.2 方法

1.2.1 血液標(biāo)本采集

在麻醉后手術(shù)開始前和術(shù)中完成Le FortⅠ型截骨術(shù)后采集靜脈血各2 ml，采血組件為奧地利格雷拉公司生產(chǎn)的真空采血管針(Greiner bioone，Austria)，抗凝劑為按1∶9稀釋的枸櫞酸鈉。

1.2.2 血小板分離與固定

將采集的靜脈血在常溫下立即3 000 r/min離心10 min，小心取出上層血漿，置-70 ℃冰箱中保存，作11DHTXB2檢測。勿攪動中間呈白膜狀的血小板層（富血小板血漿層）。然后沿管壁緩慢加入0.5%戊二醛固定液，置4 ℃冰箱中靜置30 min，初步固定已分層的血小板。待血小板層呈凝膠狀態(tài)后小心取出凝膠層放入離心管中，再加入3%戊二醛固定液固定4 h作進一步的包埋處理。

1.2.3 血小板超微結(jié)構(gòu)觀察

血小板凝膠用1%鋨酸固定，酒精逐級脫水(體積比70%～100%)，Epon812環(huán)氧樹脂包埋，制成5 μm半薄切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重電子染色后在電子顯微鏡(JOEL 100， Japan)下觀察血小板超微結(jié)構(gòu)。每例切片隨機選擇10個視野，在相同放大倍數(shù)下隨機計數(shù)20個血小板內(nèi)α-顆粒數(shù)目。

1.2.4 血漿11DHTHB2測定

采用酶聯(lián)免疫法檢測血漿中11DHTXB2（試劑盒為Cayman公司產(chǎn)品，美國），操作程序嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書進行。先將標(biāo)準(zhǔn)品及待測樣品均用11DHTXB2 Buffer緩沖液稀釋后置室溫中保存2 h，然后在96孔酶標(biāo)板（鼠單克隆抗體包被，蛋白封閉）中依次加入倍比稀釋的11DHTXB2標(biāo)準(zhǔn)品（從500 ng/L開始稀釋，共8點）或待測血漿（11DHTXB2 Buffer 稀釋2倍）各50 μl，兔抗11DHTXB2抗體和乙酰膽堿酯酶標(biāo)記的11DHTXB2各50 μl。在11DHTXB2抗體量不足的情況下，酶標(biāo)11DHTXB2標(biāo)準(zhǔn)品或待測血漿中的11DHTXB2競爭性地與之結(jié)合后，再與包被在酶標(biāo)板上的鼠源性單抗結(jié)合。混勻置室溫孵育2 h后，傾棄孔內(nèi)液體，用wash buffer洗滌5遍，各孔加酶底物（Ellman試劑，現(xiàn)配）200 μl，避光置搖床上顯色60～90 min。用酶標(biāo)儀在λ=405 nm處測定吸光度，11DHTXB2濃度由全自動酶標(biāo)儀（Triturus， Spain）根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線自動計算獲得。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 所有結(jié)果以（x±s）標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計軟件采用SPSS for windows 13.0。根據(jù)資料性質(zhì)采用MannWhitney檢驗、T檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果 所有受試者在術(shù)中術(shù)后均無不良事件發(fā)生，兩組患者血漿11DHTXB2水平見表2。血小板超微結(jié)構(gòu)觀察顯示，兩組血小板形態(tài)保存完整，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)清晰，α-顆粒數(shù)目較多且容易辨認(rèn)，血小板超微結(jié)構(gòu)均未見異常。兩組術(shù)前血小板結(jié)構(gòu)和α-顆粒數(shù)目無統(tǒng)計學(xué)差異，但實驗組術(shù)中血小板內(nèi)α-顆粒數(shù)目減少，α-顆粒相對聚中，且血小板內(nèi)開放管道系統(tǒng)增多(圖1，2)。實驗組血小板內(nèi)平均α-顆粒數(shù)為（12.3±3.7）個，對照組血小板內(nèi)α-顆粒平均為（18.4±7.6）個，兩組血小板內(nèi)α-顆粒數(shù)目比較具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。表2 兩組患者血漿11DHTXB2水平比較（略）

3 討論 血小板受到生理刺激時，儲存在致密體、α顆粒和溶酶體內(nèi)的許多物質(zhì)即可釋放到細(xì)胞外。致密體內(nèi)主要有ADP、5HT、鈣離子等，α顆粒內(nèi)容物主要有β-血小板球蛋白、血小板第4因子、凝血因子Ⅴ、血管性血友病因子等[2]。致密體內(nèi)容物在受到弱刺激物如ADP、低濃度膠原作用下即可引起釋放，而溶酶體內(nèi)容物要在強刺激物作用下才可引起釋放。血小板的許多釋放產(chǎn)物可以進一步引起血小板的活化與聚集，如ADP、血栓烷A2 (Thromboxane A2， TXA2)。在血小板釋放反應(yīng)中，某些顆粒膜蛋白或特異的蛋白質(zhì)被釋放到血漿中或出現(xiàn)在血小板膜表面，這些蛋白質(zhì)已被作為血小板活化的分子檢測物，如存在于α顆粒上的GMP140，在血小板活化時與血小板表面的質(zhì)膜融合，并在血小板膜上表達(dá)或出現(xiàn)在血漿中，而在靜息血小板上GMP140極少。正常生理刺激條件下，血小板內(nèi)α顆粒數(shù)目減少標(biāo)志著血小板處于活化狀態(tài)[4]。 血小板花生四烯酸代謝的主要活性產(chǎn)物是TXA2，它很不穩(wěn)定，半衰期僅30 s，很快轉(zhuǎn)變成穩(wěn)定的無活性的TXB2。但TXB2并不是最終產(chǎn)物，它在體內(nèi)經(jīng)肝臟酶的作用進一步氧化代謝，最終形成2，3-去二甲基-TXB2和11DHTXB2。一般采用氣相色譜-質(zhì)譜法、應(yīng)用放射免疫法或酶標(biāo)法測定血漿中TXB2的濃度來代表體內(nèi)TXA2的生成，了解體內(nèi)血小板活化的情況。但采血取樣過程以及隨后的實驗操作極易導(dǎo)致血小板的體外活化，血小板在體外產(chǎn)生TXB2的能力很強，可達(dá)300～400 μg/L，比正常血漿的TXB2濃度高幾千倍。因此，少數(shù)血小板在體外活化就可能影響血漿TXB2的測定結(jié)果，不能真實反映體內(nèi)血小板的活化情況。理論上，TXB2的體內(nèi)酶代謝產(chǎn)物不在血液中形成，能真實反映體內(nèi)TXA2的生成水平。有研究表明，血小板的體外活化并不影響11DHTXB2的濃度，認(rèn)為11DHTXB2可作為一項反映體內(nèi)TXA2生成水平的可靠指標(biāo) [5，6]。近年來國內(nèi)外已普遍采用11DHTXB2測定代替TXB2作為體內(nèi)血小板活化的指標(biāo) [7，8]。 云南白藥是止血中藥，Chew[9]觀察發(fā)現(xiàn)云南白藥可引起血小板釋放，從而起到止血作用。張小梅等[10]研究云南白藥對圍手術(shù)期病人血小板表面糖蛋白的表達(dá)及血小板超微結(jié)構(gòu)有影響，服用云南白藥后，血小板表面糖蛋白表達(dá)增加，活化血小板增多，血小板表面突起增多，血小板小管開放，釋放增多，提示服用云南白藥能增加血小板活性、血小板聚集及與纖維蛋白原受體的結(jié)合能力。楊吉林等[11]研究發(fā)現(xiàn)骨科手術(shù)病人術(shù)前2日口服云南白藥膠囊后，可使血小板激活，血小板細(xì)胞表面羽狀突起增多，胞質(zhì)內(nèi)顆粒因排空而減少，開放小管增多且管腔擴大，腔內(nèi)可見排放的顆粒，血小板胞質(zhì)內(nèi)還可見α-顆粒排空減少。 本研究通過觀察口服云南白藥膠囊后血小板的超微結(jié)構(gòu)變化和檢測11-DHTXB2水平變化，研究云南白藥膠囊對血小板釋放和代謝反應(yīng)的影響。結(jié)果顯示，口服云南白藥膠囊后，在手術(shù)刺激下，血小板內(nèi)α顆粒數(shù)量減少，開放管道系統(tǒng)增加，說明血小板釋放功能加強，增加了凝血功能，從而有利于術(shù)中更快止血。然而，口服云南白藥膠囊后血漿11DHTXB2含量反而較對照組減低，提示血小板膜磷脂代謝反應(yīng)被抑制，這可能與云南白藥具有促進機體凝血作用的機制有關(guān)。實驗組血漿11DHTXB2水平低，間接反映了血漿中TXA2的生成較低，而TXA2為強烈的縮血管物質(zhì)和促進血小板聚集的物質(zhì)，術(shù)后持續(xù)的TXA2升高對組織腫脹的消退不利，并可能導(dǎo)致異常血栓形成。口服云南白藥膠囊后抑制了TXA2的生成，減輕了術(shù)后局部組織中微血管的收縮反應(yīng)，改善了微循環(huán)狀況，可能有利于術(shù)后組織腫脹的消退。由于云南白藥中含有多種生物活性物質(zhì)，其止血作用可能并不是單純通過增強血小板的TXA2代謝反應(yīng)，促進血小板的聚集途徑來完成的，需通過其它途徑做進一步研究。 本研究顯示，在手術(shù)刺激條件下，血小板內(nèi)α顆粒釋放增加，數(shù)目減少，提示云南白藥膠囊可促進術(shù)中血小板的活化，有利于手術(shù)中止血，從而減少了術(shù)中出血量。同時服用云南白藥后抑制了血小板膜磷脂代謝，血漿11DHTXB2水平減低，反映了具有強烈收縮血管作用的TXA2生成也減少，可能對改善術(shù)后手術(shù)創(chuàng)傷區(qū)域組織微循環(huán)有利，加快腫脹組織消退。