作者：廖敬禮，顧健，李婧，張亮亮，鐘鋒，姚峰

【摘要】 目的建立測定齊墩果酸血漿濃度的HPLC方法，研究唐古特青蘭醇提取物中齊墩果酸的藥代動力學規(guī)律。方法采取甲醇-水(85∶15，V/V)為流動相，Diamonsil C18 柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)為固定相，紫外檢測波長為215 nm測定，大鼠灌胃給藥3.0，1.5 g/kg，用HPLC法測定給藥大鼠血漿中齊墩果酸的含量，采用藥代動力學軟件DAS(ver2.0)處理，得到齊墩果酸的藥代動力學參數(shù)。結(jié)果大鼠灌胃高劑量和低劑量給藥的齊墩果酸主要參數(shù)分為AUC0-t 為49 450.915 mg/( L·min)和37 336.884 mg/( L·min)，tl/2為85.154 min和55.215 min。結(jié)論齊墩果酸在大鼠體內(nèi)的代謝符合一室模型，吸收、消除較快。

【關(guān)鍵詞】 唐古特青蘭; 齊墩果酸; 藥代動力學; 高效液相色譜

唐古特青蘭又名甘青青蘭( Dracocephalum tanguticum Maxim，簡稱DtM)，藏文譯音“知羊格”，是藏醫(yī)常用藥材，屬多年生唇形科草本植物，生長在海拔1 900～4 600 m的青藏高原。其性寒、味甘苦，可清肝胃之熱，用于治療胃炎、肝炎、頭暈、關(guān)節(jié)炎、胃潰瘍、神疲等[1]，主含黃酮苷、揮發(fā)油、氨基酸、甾類、齊墩果酸、熊果酸、胡蘿卜苷等[2]。研究發(fā)現(xiàn)，DtM的醇提液可以有效降低大鼠的血糖濃度，具有降血糖的藥理作用，DtM水提液可升高缺氧動物紅細胞 SOD含量、清除氧自由基，降低整體耗氧量，具有抗心腦組織缺氧的作用，可改善缺氧造成的血液流變學異常、血小板減少、右心室肥厚及組織病理學損傷。其藥用價值顯著，但目前對唐古特青蘭用于治療這方面疾病的研究不少，大多數(shù)對其在體內(nèi)的代謝還不清楚，或僅限于理論上的論述，不便于對其進行研究和利用，且未見文獻報道。為此我們對DtM的醇提液中齊墩果酸在大鼠體內(nèi)的代謝進行藥代動力學研究。

1 材料與儀器

1.1 動物 健康Wistar雄性大鼠12只，體質(zhì)量(250±50)g，由四川省實驗動物中心提供，合格證號：SCXK[川]2008-14。

1.2 儀器 島津LC-10AT高效液相色譜儀;Diamonsil C18 柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);SPD-M10Avp UV-VIS檢測器;CTO-1OA柱溫箱;C-R7Ae色譜數(shù)據(jù)處理儀;SIL-1OADvp自動進樣器;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海夏豐實業(yè)有限公司);精密天平(沈陽龍騰電子有限公司);臺式高速離心機;HY調(diào)速多用振蕩儀(江蘇正基儀器有限公司);YGL系列氮吹儀(成都雅源科技有限公司);微孔濾膜(0.45 μm)。

1.3 試劑及藥品 甲醇;醋酸乙酯;無水乙醇;高純水(自制);肝素;唐古特青蘭(采自青海，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學中藥室鑒定為唇形科植物唐古特青蘭的帶根全草。)

1.4 藥物的制備 取115 g原藥材，加入700 ml 95%的乙醇溶液中，加熱煮沸2h，過濾，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇，濃縮成相當于生藥量0.45，0.90g/ml的溶液，保存?zhèn)溆谩?/p>

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件Diamonsil C18 柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相為甲醇-水(85∶15，V/V);柱溫30 ℃ ;流速 1.0 ml/min;檢測波長215nm。

2.2 血樣處理 在100 μl血漿加入0.1 ml乙酸乙酯，振蕩5 min，6 000 r/min離心，取上清液，加0.3 ml甲醇沉淀蛋白，振蕩5 min，6 000 r/min離心，取上清液，50℃氮氣吹干。用1.0 ml流動相溶解，取10 μl進樣分析，測定峰面積。

2.3 對照品溶液的制備 取對照品恒溫干燥至恒質(zhì)量，精密稱取5.0 mg 齊墩果酸對照品，置5.0 ml容量瓶中，用流動相溶解，超聲5 min，定容至5.0 ml，得到1.0 mg/ml 對照品溶液。

2.4 標準曲線的制備 精密量取大鼠空白血漿0.1 ml，分別加入齊墩果酸標準品，配制成血漿濃度分別為:10，20，30，40，50 μg/ml血漿溶液，按上述血樣處理過程處理，分別取10 μl進樣，記錄峰面積，以峰面積值(Y)對齊墩果酸的濃度(X)進行線性回歸。

2.5 精密度實驗取大鼠空白血漿0.1 ml，用標準品配制成濃度分別為10，20，40 μg/ml的血漿溶液，按“2.2”項操作，測定樣品峰面積。代入標準曲線方程，計算測得濃度，考察日內(nèi)和連續(xù)5d的日間變異情況。

2.6 回收率實驗分別用空白血漿配制齊墩果酸質(zhì)量濃度為10，20，40 μg/ml，的樣品， 按“2.2”項操作，測定樣品峰面積。代入標準曲線方程，計算測定濃度。

2.7 動物實驗大鼠給藥前禁食，自由攝水，實驗隨機分為兩組，每組6只，分別為高、低劑量組。按3.0 g/kg， 1.5 g/kg灌胃給藥。給藥后5，10，20，30，45，60，90，120，180，240，360 min后分別于尾靜脈取血，每次取血0.5 ml于肝素處理的離心管中，離心，取100 μl上清液，按“2.2”項操作。

2.8 藥動學參數(shù)計算 所得血藥濃度-時間( C-T)數(shù)據(jù)用藥代動力學分析軟件DAS(ver2.0)程序處理。

3 結(jié)果

3.1 線性關(guān)系 以峰面積值(Y)對齊墩果酸的濃度(X)進行線性回歸，得回歸線方程：Y=3 089.5X-6 481.2，r=0.999 09。結(jié)果表明齊墩果酸在10～50 μg/ml關(guān)系良好，保留時間為23.3 min，齊墩果酸色譜圖見圖1。

3.2 精密度實驗從表l可知該方法精密度好，日內(nèi)及日間誤差(RSD)都比較小。

3.3 回收率實驗 由表2可知，高、中、低3個質(zhì)量濃度的回收率均大于90%。

3.4 動物實驗結(jié)果 將實驗所得齊墩果酸的血藥濃度-時間數(shù)據(jù)，經(jīng)藥代動力學分析軟件DAS(ver2.0)處理，經(jīng)由計算機進行曲線擬合，得唐古特青蘭醇提取物中齊墩果酸在健康大鼠體內(nèi)的藥代動力學參數(shù)(見表3～4)及藥-時曲線圖(見圖2)。結(jié)果顯示，大鼠灌胃給藥后，齊墩果酸在血液里60 min時達到最高血藥濃度。高低劑量對比，藥-時曲線線性關(guān)系良好，所得最佳房室數(shù)為一室，權(quán)重系數(shù)為1，清除率基本一致。圖1 齊墩果酸色譜圖表1 齊墩果酸在大鼠血漿中的精密度實驗結(jié)果表2 齊墩果酸在大鼠血漿中的回收率實驗結(jié)果

4 討論

4.1 分析方法學 齊墩果酸易溶于甲醇、醋酸乙酯、氯仿中，經(jīng)反復試驗，并

4.2 藥代動力學 對大鼠灌胃唐古特青蘭的醇提物齊墩果酸，血藥濃度-時間數(shù)據(jù)經(jīng)DAS(ver2.O)藥代動力學分析軟件處理，所得最佳房室數(shù)為一室，權(quán)重系數(shù)w為1，采用高劑量組和低劑量組灌胃給藥，這兩種劑量的半衰期，清除率基本一致，同時無觀察到毒性反應(yīng)現(xiàn)象，說明給藥劑量合理，線性關(guān)系良好。綜上所述，唐古特青蘭在大鼠體內(nèi)藥代動力學規(guī)律明顯，吸收、消除較快，代謝迅速，所得結(jié)果可為臨床合理用藥提供科學依據(jù)。