作者：鐘華，尹蓉莉，高劍坤，周淑芳，趙啟鵬，文登福，江洪波，田仁君

【摘要】 目的建立HPLC 檢測家兔血漿中牻牛兒酮濃度的方法。方法運用HPLC研究并比較了經皮給藥以及注射給藥后牻牛兒酮在家兔體內的藥物動力學過程。結果其中經皮給藥Tmax為(7.333±1.633)h，Cmax為(100.233±53.360)ng/ml，t1/2為(10.209±2.393)h，而注射給藥后， Tmax為0 h后，Cmax為(273.45±137.189)ng/ml，t1/2為(14.867±10.138)h。結論經皮給藥藥物代謝較完全，與注射給藥相比，具有毒副作用小，且能達到持效、長效的目的。

【關鍵詞】 莪術微乳凝膠; 經皮給藥系統; 注射給藥; 藥代動力學

莪術作為傳統中藥具有活血化瘀的功效， 現代研究表明，其活性成分對皮膚癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌、食管癌、胃癌、直腸癌等等都有一定程度的治療以及輔助治療作用，可以改善血液流變學參數以及增強在體對病毒性感染的抵抗能力，起到對實體腫瘤以及病毒性感染的治療以及輔助治療作用[1]。莪術微乳凝膠是將莪術微乳作為中間體形式制成水凝膠劑，該劑型集中了微乳對藥物的徹底分散性，凝膠對皮膚的粘合性以及潤濕性，使藥物直接持續地發揮藥效，增強了制劑的療效、穩定性和靶向性、減小了其毒副作用，使藥物以恒定速度 (或接近恒定速度)通過皮膚各層或黏膜，產生全身或局部治療作用，尤其適宜于皮膚癌的治療。本實驗運用HPLC法研究并比較了經皮給藥以及注射給藥后牻牛兒酮在家兔體內的藥物動力學過程，為莪術微乳凝膠的臨床應用提供參考依據[2～4]。

1 儀器與試藥

莪術微乳凝膠(自制)，牻牛兒酮對照品(中國藥品生物制品鑒定所，批號111665-2000401);乙腈為色譜純，水為超純水，三氯醋酸、異丙醇、正丁醇、無水硫酸鈉為分析純，其余試劑均為分析純。家兔6只，體質量(2.5±0.5)kg，實驗動物中心提供。LC-10ATVAP型高效液相色譜儀，Prostar 325型二極管陣列檢測器。micromax高速離心機(美國熱電)。

2 方法與結果

2.1 血漿樣品的高效液相檢測方法

2.1.1 沉淀劑的制備稱取三氯醋酸10 g，加到100 ml異丙醇正丁醇溶液(5∶1)中，振蕩使溶解，得到血漿蛋白沉淀劑。

2.1.2 血漿樣品預處理家兔耳緣靜脈取血2ml，置于預先加入肝素抗凝的10 ml離心管中，3 000 r·min-1離心10 min，分離血漿。取血漿500 μl置于10 ml離心管中，旋渦混合10 s，加入沉淀劑150 μl，旋渦混合30 s，3 000 r·min-1離心10 min，取上清液置于另一離心管中，加入無水硫酸鈉100 mg，旋渦混合1min，使硫酸鈉溶解，3 000 r·min-1離心5 min，吸取上層澄清液，取20 μl進樣測定。

2.1.3 高效液相分析條件色譜柱為HypersilCN(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相為乙腈-水(40∶60);流速1.0 ml/min ;檢測波長210 mm;進樣20 μl;溫度35℃。典型色譜圖：在上述條件下測得空白血漿、空白血漿加入實驗標準品、實驗采集血漿樣品的典型色譜圖1。最低檢測限和最低定量限的測定：通過測定，牻牛兒酮的最低檢測限和最低定量限的測定分別1 ng/ml和10 ng/ml。圖1 藥代動力學HPLC圖

2.2 標準曲線的制備

2.2.1 牻牛兒酮標準溶液的配制精密稱取牻牛兒酮標準品10.0 mg，置于10 ml容量瓶中，加異丙醇溶解定溶，得濃度為1 mg/ml的標準液儲備液。精密吸取儲備液于10 ml容量瓶中，分別配制成濃度為50，5，0.5 μg/ml的標準液。

2.2.2 牻牛兒酮血漿標準曲線的制備取空白血漿0.5 ml，加入牻牛兒酮標準液適量，制備成濃度分別為10，20，50，100，500，1000 ng/ml的標準血漿樣品，按樣品處理方法項下進行處理測定，計算牻牛兒酮峰面積，以牻牛兒酮的血藥濃度進行線性回歸，得藥物血漿曲線方程。本方法測定血漿中牻牛兒酮的最低檢測限為0.63 ng·ml-1，最低檢測濃度為1 ng/ml，最低定量限為10 ng/ml，標準曲線見表1，圖2。其血藥濃度標準曲線方程為：Y= 60.91X + 4 155.1 (r=0.999 0，n=6)。表明牻牛兒酮在血漿中濃度10～10 000 ng·ml-1范圍內線性良好。

2.2.3 分析方法的專屬性所測物質牻牛兒酮在上述色譜條件下保留時間適當，血漿內源性物質及所用試劑在待測峰附近無干擾峰產生，滿足待測藥物的體內含量測定的條件，該分析方法的專屬性良好。

2.2.4 分析方法回收率配置濃度為50 ，500，1 000 ng·ml-1的牻牛兒酮標準溶液，與對應濃度的血漿樣品進行比較，求出絕對回收率。結果見表2。表1 牻牛兒酮血漿濃度線性與范圍圖2 血藥濃度標準曲線圖表2 分析方法回收

2.2.5 絕對回收率 配制濃度為50，500，1 000 ng·ml-1的低、中、高3種牻牛兒酮標準血漿樣品，按上述血漿樣品預處理步驟操作，血漿樣品中牻牛兒酮色譜峰面積代入標準曲線，通過測得濃度與理論濃度的比值求得相對回收率。結果見表3。表3 樣品絕對回收率

2.2.6 分析方法精密度配制濃度為50 ，500，1 000 ng·ml-1的低、中、高三種牻牛兒酮標準血漿樣品，按上述血漿樣品預處理步驟操作，同日內及日間分批測定，計算日內和日間相對標準差，結果見表4，精密度達到要求。表4 日內日間精密度測定

2.3 莪術微乳凝膠藥物動力學研究

2.3.1 實驗設計及取樣方法取家兔6只，隨機分成兩個實驗組，每組3只。實驗前1 d小心剃去腹部皮毛(10 cm×10 cm)，注意不要損傷皮膚，禁食一夜，自由飲水。莪術微乳凝膠經皮給藥方案及血樣采集：按一定劑量經皮給藥，將凝膠貼敷于家兔皮膚上，于給藥后0.5，1，2，4，6，8，10，14，18 ，24 h從家兔耳緣靜脈取血2 ml至預先加入肝素抗的離心管中，3 000 r/min離心10 min取血漿冰凍保存待測，按樣品處理項下方法進行處理測定。得血藥數據，表3～5。莪術微乳注射給藥方案及血樣采集：于耳緣靜脈按一定劑量注射莪術微乳，于給藥后0.0，0.5，1，2，4，6，8，10，14，18 ，24 h另側耳緣靜脈取血2ml至預先加入肝素抗的離心管中，3 000 r/min離心10 min取血漿冰凍保存待測，按樣品處理項下方法進行處理測定。得血藥數據。

2.3.2 數據處理單劑量對家兔經皮給藥后血藥濃度見表5、圖3，單劑量對家兔注射給藥后血藥濃度見表6，圖4。所測數據用3P97藥動學數據處理軟件進行處理，得其動力學參數見表7～8。表5 單劑量對家兔經皮給藥后不同時間的血藥濃度圖3 單劑量經皮給藥血藥濃度圖表6 單劑量對家兔注射給藥后不同時間的血藥濃度圖4 單劑量注射給藥血藥濃度圖表7 單劑量對家兔經皮給藥動力學參數表8 單劑量對家兔注射給藥動力學參數

3 結果

從實驗結果可見，莪術微乳凝膠經皮給藥及注射給藥在家兔體內均為二室模型，其中經皮給藥Tmax為(7.333±1.633) h，Cmax為(100.233±53.360) ng/ml，t1/2為(10.209±2.393) h，而注射給藥后， Tmax為0 h后，Cmax為(273.45±137.189)ng/ml，t1/2為(14.867±10.138) h。莪術微乳凝膠的達峰時間(Tmax)較長，達峰濃度(Cmax)較高，消除半衰期(t1/2)較短，與注射給藥相比，經皮給藥藥物代謝較完全，具有毒副作用小，且能達到持效、長效的目的。