作者：王桂紅，劉丹，吳杰，邴飛虹，張國(guó)斌，鄭國(guó)華

【摘要】 目的研究霉茶總黃酮在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)。方法以蛇葡萄素為指標(biāo)，高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定給藥后大鼠血清中蛇葡萄素的濃度。結(jié)果大鼠灌胃0.5 h后血清中即可檢測(cè)出蛇葡萄素，霉茶總黃酮在大鼠體內(nèi)呈一室模型分布，且藥物在高、中、低劑量時(shí)的藥物濃度變化比較一致。結(jié)論HPLC法適用于測(cè)定大鼠體內(nèi)霉茶總黃酮血藥濃度，總黃酮在大鼠體內(nèi)吸收很快，濃度對(duì)藥物的體內(nèi)代謝行為沒(méi)有明顯影響。

【關(guān)鍵詞】 霉茶總黃酮； 蛇葡萄素； 藥代動(dòng)力學(xué)； 大鼠； 高效液相色譜法

霉茶系葡萄科蛇葡萄屬植物大葉蛇葡萄Ampelopsis.megalophylla Diels et. Gilg的枝葉加工而成，其主要活性成分為霉茶總黃酮，臨床上用于降血壓、降血脂［1］。有關(guān)霉茶總黃酮的藥代動(dòng)力學(xué)研究報(bào)道較少，為了進(jìn)一步了解霉茶總黃酮的降壓機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)對(duì)霉茶總黃酮在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究。

1 材料與儀器

1.1 藥品與試劑

霉茶總黃酮、蛇葡萄素對(duì)照品（自制），乙腈(色譜純)，霉茶總黃酮用4% CMC-Na溶液加熱溶解成所需濃度。

1.2 動(dòng)物

SD大鼠，體重200～250 g，雌雄各半，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供，許可證號(hào)：SCXY（鄂）2004-00070。室溫18～20℃，實(shí)驗(yàn)期間飼以該中心提供的固體飼料，自由飲水。

1.3 儀器

LG16-W型離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；XW-80A旋渦混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；Agilent-1100系列高效液相色譜儀（四元泵）、紫外檢測(cè)器及配套色譜工作站；Mettler-Toledo AG285型分析天平。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱為Aichrom Bond-AQ C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）； YWG-C18 保護(hù)柱，檢測(cè)波長(zhǎng)為292 nm，流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸水（25∶75），流速為1.0 ml·min-1；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：5 μl。

2.2 血液樣品的制備與處理［2］

取36只大鼠，禁食過(guò)夜，隨機(jī)分為霉茶總黃酮高、中、低3個(gè)劑量組（灌胃劑量分別為：360，180，90 mg·kg-1），每只大鼠取6個(gè)時(shí)間點(diǎn)、3個(gè)平行，單次灌胃給藥后分別于0.5，1.0，1.5，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，10.0，12.0 h眶靜脈取血0.5 ml，4 000 r·min-1離心10 min，分離出血漿，定量吸取血漿0.2 ml，加0.6 ml乙腈沉淀蛋白，渦流混旋10 min，4 000 r·min-1離心10 min，取上清液，濾膜濾過(guò)(0.45 μm)，進(jìn)樣5 μl，以峰面積進(jìn)行定量。

2.3 對(duì)照品系列溶液的制備

分別精密稱取蛇葡萄素對(duì)照品適量，以甲醇溶解并稀釋至刻度配制成不同濃度的對(duì)照品儲(chǔ)備液（1 200，800，600，400，200 μg·ml-1），4℃保存?zhèn)溆谩＞芪∩咂咸阉貙?duì)照品儲(chǔ)備液適量，加甲醇定容，梯度稀釋為800，200，120，80，40，8，4 μg·ml-1的對(duì)照品溶液。

2.4 對(duì)照品系列模擬血漿樣品的制備

分別精密吸取上述稀釋的系列對(duì)照品溶液各0.1 ml，然后用大鼠空白血漿分別定容至1 ml，使血漿濃度分別為80，20，12，8，4，0.8，0.4μg·ml-1的對(duì)照品溶液。

2.5 數(shù)據(jù)處理 藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)由MCPKP軟件計(jì)算［3］。

3 結(jié)果

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

含藥血漿按前述“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行操作，分別進(jìn)樣0.002，0.004，0.02，0.04，0.06 μg，測(cè)定并記錄蛇葡萄素的峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），標(biāo)準(zhǔn)曲線如下：Y= 3 258X- 1.236，R = 0.999 9，線性范圍0.002～0.06 μg，最低檢測(cè)限為0.000 4 μg·ml-1。

3.2 方法回收率和精密度的考察

按照含藥對(duì)照品系列溶液配制方法，配制不同濃度的血漿對(duì)照品溶液，依次為12，8，4μg·ml-1。然后按照“2.2”項(xiàng)下同法操作，精密進(jìn)樣5 μl，記錄蛇葡萄素的峰面積。按照外標(biāo)法，代入線性方程計(jì)算蛇葡萄素的血漿藥物濃度，計(jì)算所得濃度與實(shí)際濃度的比值，并計(jì)算日內(nèi)精密度。方法的回收率分別為：91.83%，93.75%，86.25%，日內(nèi)精密度為：7.56%，6.40%，5.68%。連續(xù)3 d測(cè)定上述濃度樣品，結(jié)果日間精密度為：8.02%，7.08%，6.72%。符合生物樣品中藥物定量分析研究的方法學(xué)要求。

3.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取與回收率實(shí)驗(yàn)用同樣血漿對(duì)照品溶液9份，濃度為 12，8，4 μg·ml-1，每個(gè)濃度3個(gè)平行。按照血液樣品制備方法預(yù)處理后室溫放置4 h，24 h和經(jīng)3，5，7 d 3次冷凍-解凍循環(huán)后蛇葡萄素的穩(wěn)定性，RSD分別為：1.97%，2.90%，2.60%。不同濃度的含藥血漿樣品在放置7 d之內(nèi)RSD<3%，表明樣品在7 d內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.4 蛇葡萄素的血藥濃度測(cè)定

霉茶總黃酮高、中、低劑量組大鼠體內(nèi)的蛇葡萄素血藥濃度均在1.5～2.5 h達(dá)高峰，2.5 h后開(kāi)始下降。血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)由MCPKP軟件處理，各項(xiàng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表1，血藥濃度變化見(jiàn)圖1。表1 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（略）

4 討論 霉茶總黃酮的體內(nèi)藥物代謝符合一室模型。藥物在高、中、低劑量時(shí)的藥物濃度變化比較一致。整個(gè)藥物的體內(nèi)代謝符合一室模型，且藥物均有一定的肝腸循環(huán)，在體內(nèi)的生物半衰期時(shí)間為4.5～5.5 h左右，血藥濃度較快到達(dá)最大值，但是會(huì)持續(xù)一個(gè)時(shí)間段，可能與蛇葡萄素的結(jié)構(gòu)有相關(guān)性。

對(duì)于大部分的黃酮類化合物，肝臟和消化道是藥物代謝的主要場(chǎng)所，藥物在胃腸道內(nèi)即發(fā)生代謝、吸收，進(jìn)入體內(nèi)的是其代謝產(chǎn)物而非原形成分［4］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［5］，小鼠灌胃給藥180 mg·kg-1，血清中僅有痕量蛇葡萄素。本實(shí)驗(yàn)在霉茶總黃酮最大耐受量［6］范圍內(nèi)按360，180，90 mg·kg-1給藥，0.5 h后即可檢測(cè)出蛇葡萄素，與以往報(bào)道不同。至于霉茶總黃酮在大鼠胃腸道內(nèi)是否完全代謝分解，有待進(jìn)一步研究。