【摘要】 目的 觀察冠心丹參注射液對(duì)健康成年SD大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。方法 SD大鼠以結(jié)扎冠脈30 min再灌注90 min造成心肌缺血再灌注損傷模型，通過觀察血流動(dòng)力學(xué)、生物化學(xué)和組織學(xué)指標(biāo)，評(píng)價(jià)大鼠缺血再灌注前冠心丹參片預(yù)處對(duì)左心室收縮壓(LVSP)、左心室發(fā)展壓(LVDP)、左心室舒張末壓(LVEDP)、左心室等容期壓力最大變化速率(±dp／dtmax)等指標(biāo)的影響；通過測定再灌注90 min后血中乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)活性和心肌組織病理學(xué)觀察，對(duì)藥物保護(hù)心肌作用進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果 表明冠心丹參注射液可有效改善缺血再灌注心臟的縮舒功能；降低缺血再灌注末期血中LDH和CK活性；組織病理學(xué)檢查表明：與溶劑對(duì)照組比較，冠心丹參注射液預(yù)處理組能明顯減輕心肌組織的損傷。結(jié)論 冠心丹參注射液有抗大鼠缺血再灌注引起的心肌損傷作用。

【關(guān)鍵詞】 冠心丹參注射液；心肌保護(hù)；缺血再灌注

Abstract：Objective To observe the cardioprotective effects of Guanxin Danshen injection on myocardium injury induced by ischemia reperfusion in anesthetized adult SD rats．Methods The myocardial injury of rats induced by ischemia-reperfusion was produced by the ligation of left coronary artery for 30 min followed by 90 min reperfusion．The influence of Guanxin Danshen injection on the changes of biochemistry，histology and hemodynamics，such as LVSP，LVDP ，LVEDP and dp／dtmax，were evaluated．The serum lactate dehydrogenase(LDH) and creatine kinase(CK)activities were assayed by the end of the reperfusion．Results The systolic and diastolic functions were improved，and the serum LDH and CK activities were reduced in Guanxin Danshen injection 100 mg/kg iv group．The histology changes were manifested．The pretreatment of Guanxin Danshen injection alleviated the myocardial damage distinctly，compared with ischemia-reperfusion group．Conclusions The experimental results demonstrate the effects of Guanxin Danshen injection on myocardial injury induced by ischemia-reperfusion in anesthetized rats．

Key words:Danshen Guanxin injection; myocardial protection; ischemia reperfusion

1 冠心丹參注射劑的優(yōu)點(diǎn)及提取工藝簡介

天然植物中有許多活性物質(zhì)具有抗心肌缺血，缺氧作用，其中一些已開發(fā)成治療冠心病和心絞痛的新藥。冠心丹參片的主要成分為丹參，三七，降香油，具有活血化瘀，理氣止痛的作用。用于氣滯血瘀所致的胸悶，胸痹，心悸氣短；冠心病等上述證狀者。片劑口服雖然相對(duì)安全但起效慢，尤其在治療一些急癥時(shí)，凸顯出劑型的不足，所以將具有抗心肌缺血，缺氧活性的有效物質(zhì)制成注射劑無疑是搶救和治療冠心病和心絞痛等突發(fā)疾病的最佳方案。

丹參1 000 g，10倍量水回流提取3次，每次2 h，合并提取液，濃縮至0.2 g生藥/mL，用D101大孔吸附樹脂處理，先用2 BV注射用水洗脫，然后用3 BV80%乙醇洗脫，收集洗脫液濃縮至0.2 g生藥/mL；三七粗粉1 000 g（過40目篩），浸泡40 min，用10倍量70%乙醇回流提取3次，每次2 h，合并提取液濃縮成0.2 g生藥/mL，然后吸取提取液用已經(jīng)預(yù)處理好的D101大孔吸附樹脂柱處理：先用水洗至流出液不顯Molish反應(yīng)，然后用3 BV70%乙醇洗脫，流速為1.5 mL/min，收集洗脫液濃縮成0.2 g生藥/mL；降香飲片1 000 g，加水8 倍量，水蒸汽蒸餾提取11 h收集蒸餾液，冷藏24 h，分去上層油層。

合并上述三液，加注射用水成1 000 mL，加入注射劑用活性炭，用量為0.5%，加熱回流30 min，減壓抽濾過孔徑為0.45 μm的微孔濾膜灌封于2 mL的安瓿中采用流通蒸汽滅菌法滅菌60 min即得。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 儀器

Medlab生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)(南京美易科技有限公司)；動(dòng)物人工呼吸機(jī)(DH—1型，浙江醫(yī)科大學(xué)醫(yī)療儀器實(shí)驗(yàn)廠)；心電圖機(jī)(XDH—3B型，上海醫(yī)用電子儀器廠)。

2.1.2 藥品與試劑

冠心丹參片(廣州白云山和記黃埔中藥有限公司)，乳酸脫氫酶(LDH)測試盒及肌酸激酶(CK)測試盒(南京建成生物工程研究所)，冠心丹參注射液本實(shí)驗(yàn)室自制。

2.1.3 動(dòng)物

昆明種小鼠100只，6～8周齡，雌雄各半，體重18～22 g；健康成年SD大鼠70只，300～350 g，雌雄各半(由遼寧醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)。

2.2 方法

2.2.1 肌缺血再灌注模型制備

大鼠在麻醉下(烏拉坦1.0 g·kg-1，ip)切開頸部皮膚，氣管內(nèi)插管，接人工呼吸機(jī)，呼吸頻率55～65／min，潮氣量1.5～2 mL·100 g-1，呼-吸時(shí)比為1.25：1，壓力在0.49～1.47 kPa之間。根據(jù)呼吸頻率及深度調(diào)整呼吸參數(shù)。分離左、右頸總動(dòng)脈，左頸總動(dòng)脈插入一含0.1％肝素生理鹽水的PE管，另取一個(gè)充滿0.1％肝素生理鹽水的PE管經(jīng)右頸總動(dòng)脈插入左心室，根據(jù)顯示器所示壓力圖形改變判斷插管是否進(jìn)人心室腔。兩導(dǎo)管均連壓力換能器，分別將信號(hào)輸入到Medlab生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)，以監(jiān)測大鼠血壓和左心室血流動(dòng)力學(xué)變化。觀察指標(biāo)包括收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)和平均動(dòng)脈壓(MBP)、左心室收縮壓(LVSP)、左心室等容期壓力最大變化速率(±dp／dt)、左心室舒張壓(LVDP)、左心室舒張末壓(LVEDP)、左心室發(fā)展壓(LVDP ，系LVSP與LVEDP的差值)、心率(HR)。將針式電極固定于大鼠四肢皮下，以監(jiān)測肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖變化。沿胸骨左緣剪開3，4，5肋骨，暴露心臟，剪開心包膜。以左冠狀動(dòng)脈為標(biāo)志，用3／8圓3×10不銹鋼圓針，在左冠狀動(dòng)脈下穿一4-0絲線。進(jìn)針深度穿過心肌1 mm左右，進(jìn)出針問寬度在進(jìn)出針間寬度在動(dòng)脈周圍1.5～2 mm左右。穩(wěn)定15 min，待各指標(biāo)穩(wěn)定后記錄藥前心電圖及血壓等血流動(dòng)力學(xué)各值。將一細(xì)小PE管墊于血管與結(jié)扎線之間，拉緊結(jié)扎線使細(xì)小乳膠管壓迫左冠狀動(dòng)脈而致閉塞。以結(jié)扎后心臟局部發(fā)紺伴隨T波高聳或ST段抬高，作為結(jié)扎成功的標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)扎30 min后，松開結(jié)扎線再灌注90 min，以局部發(fā)紺逐漸變?yōu)榧t潤、心電圖ST段逐漸恢復(fù)為再灌注成功的標(biāo)志。在缺血期及再灌注期每隔15 min記錄一次上述指標(biāo)。每組8只，共4組：假手術(shù)組（Sham）、溶劑對(duì)照組(IR)、冠心丹參片預(yù)處理組(Guanxin Danshen tablet)，冠心丹參注射液預(yù)處理組(Guanxin Danshen injection)。假手術(shù)組不進(jìn)行缺血再灌手術(shù)，灌胃等容積生理鹽水；溶劑對(duì)照組進(jìn)行缺血再灌手術(shù)，灌胃等容積生理鹽水；冠心丹參片預(yù)處理組灌胃冠心丹參片的懸濁液150 mg／kg，第4組為灌胃等容積生理鹽水并肌肉注射冠心丹參注射液100 mg /kg，連續(xù)給藥兩周后進(jìn)行手術(shù)。

2.2.2 血清LDH和CK活性測定

各組最后一次血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)測定后即從左頸總動(dòng)脈取血約1 mL，2 500 r/min，離心15 min，得到大鼠血清，用LDH測試盒及CK測試盒分別測定。

2.2.3 電鏡組織學(xué)觀察

大鼠心肌缺血再灌注結(jié)束后，假手術(shù)組（Sham）、溶劑對(duì)照組(IR)、冠心丹參片預(yù)處理(Guanxin Danshen tablet)、冠心丹參注射劑預(yù)處理前(Guanxin Danshen injection)組各取2鼠心臟，用銳利刀片取左室結(jié)扎線下與心尖部中點(diǎn)左心室壁小塊心肌，體積為2 mm × 2 mm × 2 mm，用4％戊二醛處理，經(jīng)脫水、包埋、超薄切片，染色后在透射電鏡下觀察。

2.2.4 冠心丹參注射劑對(duì)夾閉小鼠氣管心電圖消失時(shí)間的影響

取小鼠32只，雌雄各半，體重18～22 g，平均體重(19.5±1.2) g，隨機(jī)分為4組，每組8只，第1組小鼠灌胃等容積生理鹽水，第2組灌胃給予冠心丹參片的懸濁液100 mg／kg，第3組小鼠灌胃冠心丹參片的懸濁液150 mg／kg，第4組為灌胃等容積生理鹽水并注射冠心丹參注射100 mg /kg，每日灌胃，連續(xù)給藥兩周，末次給藥后40 min，將小鼠用1.5％戊巴比妥鈉30 mg／kg腹腔注射麻醉，仰位固定于小鼠解剖臺(tái)上，四肢插入心電圖針形電極，置心電監(jiān)護(hù)儀下，觀察標(biāo)Ⅱ?qū)?lián)心電圖。手術(shù)剪開小鼠頸部，分離氣管，觀察從夾閉小鼠氣管至小鼠心電圖消失時(shí)間，所得數(shù)據(jù)用組間t檢驗(yàn)，比較給藥組與生理鹽水對(duì)照組之間的差異。

2.2.5 冠心丹參注射劑對(duì)小鼠常壓耐缺氧的影響

取小鼠32只，雌雄各半，體重18～22 g，平均體重（19.6±1.2 ）g，隨機(jī)分為4組，每組8只，第一組灌胃等容積生理鹽水，第2組灌胃冠心丹參片的懸濁液150 mg／kg，第3組灌胃冠心丹參片的懸濁液100 mg／kg。第4組灌胃生理鹽水，注射冠心丹參注射劑100 mg／kg，連續(xù)灌胃14 d，末次給藥后40 min，將小鼠置于內(nèi)裝200 mL廣口瓶內(nèi)，瓶口涂抹凡士林，蓋緊瓶蓋，記錄小鼠裝入瓶內(nèi)蓋緊瓶蓋至小鼠停止呼吸的時(shí)間，即為小鼠常壓耐缺氧時(shí)間，數(shù)據(jù)用組間t檢驗(yàn)。

2.2.6 對(duì)小鼠出血時(shí)間的影響

取小鼠32只，雌雄各半，體重18～22 g，平均體重（19.6±1.2） g，隨機(jī)分為4組，每組8只，第一組灌胃等容積生理鹽水，第2組灌胃冠心丹參片的懸濁液150 mg／kg，第3組灌胃冠心丹參片的懸濁液100 mg／kg。第4組灌胃生理鹽水，注射冠心丹參注射劑100 mg／kg，連續(xù)給藥7 d，末次給藥12 h，用毛細(xì)管法測定出血時(shí)間。

2.2.7 統(tǒng)計(jì)方法 采用單因與方差分析及q檢驗(yàn)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 見表1。

表1 冠心丹參注射液對(duì)大鼠缺血再灌注后左心室收縮壓(LVSP)的影響注：與溶劑對(duì)照組比較， P<0.05

3.2 見表2。

表2 冠心丹參注射液對(duì)大鼠缺血再灌注后左心室舒張壓(LVDP)的影響 注：與溶劑對(duì)照組比較， P<0.05

3.3 見表3。

表3 冠心丹參注射液對(duì)大鼠缺血再灌注后左心室等容期壓力最大變化速率組別 注：與溶劑對(duì)照組比較， P<0.05

3.4 見表4。

表4 冠心丹參注射液對(duì)大鼠缺血再灌注后左心室等容期壓力最大變化速率 注：與溶劑對(duì)照組比較， P<0.05

3.5 見表5。

表5 冠心丹參注射液對(duì)大鼠缺血再灌注后

乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)活性的影響 注：與溶劑對(duì)照組比較， P<0.05

3.6 電鏡觀察結(jié)果 假手術(shù)組心肌細(xì)胞膜完整，線粒體膜完整，嵴致密，基質(zhì)顆粒均勻(圖l A)。溶劑對(duì)照組細(xì)胞水腫，部分心肌細(xì)胞膜局部破裂；線粒體分布紊亂、腫脹，外膜破損，嵴減少、排列紊亂、模糊不清、甚至斷裂消失，基質(zhì)減少，線粒體內(nèi)大片空化(圖1 B)。冠心丹參片 組心肌線粒體改變明顯輕于溶劑對(duì)照組，心肌細(xì)胞膜無破裂，肌原纖維完整有序；線粒膜完整，嵴致密，基質(zhì)密度變淡，局部出現(xiàn)空化區(qū)域(圖1 C)。冠心丹參注射劑 組心肌細(xì)胞膜無破裂，肌原纖維完整有序；線粒體體膜完整，嵴致密，基質(zhì)顆粒均勻(圖1 D)，放大20 000倍。A.假手術(shù)組;B.溶劑對(duì)照組;C.冠心丹參片對(duì)照組;D.冠心丹參注射液對(duì)照組

圖1 電鏡觀察結(jié)果×20 0003.7 見表6。

表6 冠心丹參注射液對(duì)小鼠出血時(shí)間的影響 （n=8，±s）組別時(shí)間/s假手術(shù)組437±90.5冠心丹參片預(yù)處理組100 mg／kg533±78.2冠心丹參片預(yù)處理組150 mg／kg538±89.7冠心丹參注射劑預(yù)處理組100 mg／kg584±99.2注：與溶劑對(duì)照組比較， P<0.05

3.8 見表7。

表7 冠心丹參注射液對(duì)夾閉小鼠氣管 心電消失時(shí)間的影響 注：與溶劑對(duì)照組比較， P<0.05

3.9 見表8。

表8 冠心丹參注射液對(duì)小鼠耐缺氧 時(shí)間的影響 注：與溶劑對(duì)照組比較， P<0.05

4 討論

本實(shí)驗(yàn)通過麻醉開胸后冠脈結(jié)扎造成SD大鼠缺血再灌注心肌損傷模型，從血流動(dòng)力學(xué)、生物化學(xué)和病理組織學(xué)上綜合評(píng)價(jià)冠心丹參注射液對(duì)大鼠心肌的保護(hù)用。結(jié)果表明，冠心丹參注射液100 mg·kg-1預(yù)處理組可明顯改善大鼠心肌缺血再灌注引起的心舒縮功能和血清心肌酶學(xué)的改變，并且從超微結(jié)構(gòu)上減少缺血再灌注引起的心肌細(xì)胞線粒體損傷。冠心丹參注射液主要藥理作用為擴(kuò)張冠脈、增加冠脈流量，改善微循環(huán)，抑制血小板聚集，抗心律失常和抗血栓形成等［1］。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)大鼠冠心丹參注射液灌胃抗心肌缺血再灌注損傷作用，提示冠心丹參注射液不僅可用于治療和預(yù)防心絞痛，對(duì)于預(yù)防和治療心肌缺血再灌注損傷也有積極的治療價(jià)值。目前認(rèn)為，心肌缺血再灌注過程中，再灌注對(duì)心肌的損傷比缺血期更為嚴(yán)重，這種損傷主要與心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+ 超載有關(guān)［2］ 。有研究表明，丹參阻止Ca2+ 內(nèi)流，減輕Ca2+ 超載，減少ATP的分解，能夠減少缺血心室肌細(xì)胞APD不均一性以及緩解此時(shí)出現(xiàn)的Ca2+ 超載現(xiàn)象，因而可能減少因折返或自律性增高所導(dǎo)致的心律失常的發(fā)生。丹參具有ATP敏感鉀通道的開放作用，但丹參是否具有開放線粒體或肌漿膜的ATP敏感鉀通道作用尚待證實(shí)。