作者：吳淑華 李揚(yáng)揚(yáng) 劉魯英 趙大華 朱玉紅

【摘要】 目的 探討大腸癌組織中多藥耐藥(MDR)基因產(chǎn)物肺耐藥相關(guān)蛋白(LRP)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶π(GSTπ)、拓?fù)洚悩?gòu)酶 II(Topo II)的表達(dá)及臨床意義。方法 應(yīng)用免疫組織化學(xué)Max VisionTM法檢測122例大腸癌組織中LRP、GSTπ和TopoⅡ的表達(dá)情況，并結(jié)合臨床病理因素進(jìn)行分析。結(jié)果 ①在大腸癌組織中LRP、GSTπ和TopoⅡ表達(dá)的陽性率分別為88.5%，81.1%和77.05%;②LRP表達(dá)與性別、年齡、腫瘤大小、部位、臨床分期、浸潤深度、組織學(xué)類型等臨床病理因素均無明顯相關(guān)性(P>0.05);③GSTπ在高、中分化腺癌中的陽性表達(dá)率明顯高于低分化腺癌(P<0.05);④ TopoⅡ的表達(dá)與大腸癌發(fā)生年齡有關(guān)，年輕患者其TopoⅡ的表達(dá)明顯高于≥59歲者(P<0.05)。結(jié)論 在未化療過的大腸癌組織中，LRP 、GSTπ、Topo II均有不同程度的高表達(dá)，其表達(dá)差異與其臨床病理學(xué)特點(diǎn)具有相關(guān)性。因此，聯(lián)合檢測多藥耐藥基因，對于判斷大腸癌患者的預(yù)后以及有效的個(gè)性化治療具有重要意義。 【關(guān)鍵詞】 多藥耐藥基因;肺耐藥蛋白;谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶π;拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ;大腸癌 【Abstract】 Objective To explore the expression of multidrug resistance gene product LRP，GSTπ and TopoII in colorectal carcinoma tissue and evaluate its clinical significance.Methods The expression of LRP， GSTπ and TopoII in 122 patients with colorectal carcinoma were detected by Max VisionTM immunohistochemical technique，its correlation to clinical pathologic characteristics of colorectal carcinoma was explored.Results ① The positive rates of LRP，GSTπ and TopoII in gastric carcinoma tissue were 88.7%，81.2% and 77.4%respectively. ②LRP expression was no obviouse relation with the sex， age，tumor size， position， clinical stage， invasive depth and other clinical pathological manifestations (P>0.05). ③The positive rate of GSTπ in patients with moderately and welldifferentiated adenocarcinoma was obviously higher than that in those with poorlydifferentiated ones(P<0.05). ④A significant relationship was found between TopoII espression and patient age， that is， TopoII with high expression in older patient(≥59 years)and with low expression in young patients(P<0.05).Conclusion LRP ，GSTπ and TopoⅡare overexpressed in various degrees in colorectal carcinoma tissue without chemotherapy， and their different expressions are related to some clinical pathologic characteristics of colorectal carcinoma. Therefore， detecting the expressions of multidrug resistance gene by combining methods in colorectal carcinoma has important significance with regard to the choice of the inpidual chemotherapy and prediction of prognosis. 【Key words】 multidrug resistance gene，LRP，GSTπ，TopoⅡ，colorectal carcinoma 大腸癌是我國常見的惡性腫瘤，近年來由于飲食結(jié)構(gòu)的改變，發(fā)病率明顯增高，并且趨向年輕化，成為我國重點(diǎn)防治的腫瘤之一。除手術(shù)治療大腸癌外，化學(xué)藥物治療也是大腸癌術(shù)后治療的一個(gè)重要手段。但是惡性腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的多藥耐藥性(multidrug resistance，MDR)是導(dǎo)致臨床腫瘤化療失敗最常見而又最難解決的一個(gè)問題， MDR是指某種細(xì)胞毒藥物的耐藥細(xì)胞株對其結(jié)構(gòu)和機(jī)制各異的藥物產(chǎn)生耐藥，有多種機(jī)制參與[1]。肺耐藥相關(guān)蛋白(lung resistancerelated protein，LRP)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶π(glutathioneStransferaseπ，GSTπ)、拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ(topoisomerase Ⅱ，TopoⅡ)與MDR的產(chǎn)生有重要關(guān)系。本文檢測了122例大腸癌中LRP、GSTπ、TopoⅡ的表達(dá)情況，并結(jié)合大腸癌臨床病理特征進(jìn)行分析，探討其臨床意義，為指導(dǎo)臨床用藥、判斷預(yù)后提供理論依據(jù)。 1 材料與方法 1.1 標(biāo)本來源 收集濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2008年5月—2009年3月間手術(shù)切除的大腸癌組織標(biāo)本，選取資料齊全的病例，共122例。所有的患者術(shù)前均未進(jìn)行化療，其中男61例，女61例;年齡30～88歲，平均年齡58.9 歲，<59歲 58例，≥59歲64 例。腫瘤大小：腫瘤直徑≥5 cm者76例，<5 cm者46例;腫瘤部位：升結(jié)腸15例，橫結(jié)腸3例，降結(jié)腸12例，乙狀結(jié)腸22例，直腸70例;組織學(xué)類型：管狀腺癌104例，黏液腺癌14例，印戒細(xì)胞癌2例，乳頭狀癌2例;分化程度：高分化59例，中分化50例，低分化13例;浸潤深度：侵達(dá)黏膜或黏膜下層者6例，侵達(dá)肌層者19例，侵達(dá)漿膜或侵透漿膜層者97例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者49例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者73例。按國際癌癥防治聯(lián)合會(huì)(UICC)2002年的TNM分期，Ⅰ期和Ⅱ期共25例，Ⅲ期和Ⅳ期共97例。所有病例均為首次發(fā)現(xiàn)大腸癌，術(shù)前未行任何化療、放療。所有標(biāo)本均經(jīng)10%福爾馬林溶液固定，常規(guī)石蠟包埋。 1.2 試劑與方法 鼠抗人LRP、GSTπ和TopoⅡ單克隆抗體、Max VisionTM免疫組化試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。將石蠟標(biāo)本制成4 μm連續(xù)切片，染色程序嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行，以已知陽性的乳腺癌為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。 1.3 結(jié)果判定 以出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性標(biāo)志，LRP、GSTπ陽性表達(dá)在胞漿，TopoⅡ陽性表達(dá)在細(xì)胞核，高倍鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)視野或1 000個(gè)細(xì)胞，陽性細(xì)胞數(shù)≥10%為陽性，否則為陰性。 1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件行χ2檢驗(yàn)和Fisher精確概率法等方法對所得結(jié)果進(jìn)行檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2 結(jié)果 2.1 大腸癌中多藥耐藥基因的表達(dá)與患者的性別、年齡、腫瘤發(fā)病部位的相關(guān)性 122例大腸癌組織中LRP表達(dá)陽性的108例，陽性率為88.5%;GSTπ表達(dá)陽性的99例，陽性率為81.1%;TopoⅡ表達(dá)陽性的94例，陽性率為77.05%。本研究顯示LRP、GSTπ、TopoⅡ在大腸癌組織中均具有較高的表達(dá)率，尤其以LRP的表達(dá)為著。但與患者性別、年齡、病變部位的相關(guān)性卻不盡相同。TopoⅡ的表達(dá)與大腸癌患者的年齡有相關(guān)性，在年齡<59歲的患者中TopoⅡ的陽性表達(dá)率為98.3%，明顯高于年齡≥59歲的患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.17，P<0.05)，而LRP和GSTπ的表達(dá)與患者的性別、年齡、腫瘤發(fā)病部位均無相關(guān)性(P>0.05)，見表1。表1 多藥耐藥基因與患者的性別、年齡、腫瘤發(fā)病部位的相關(guān)性 2.2 大腸癌中多藥耐藥基因與腫瘤大小、組織學(xué)類型、分化程度的相關(guān)性 在122例大腸癌組織中LRP、GSTπ、TopoⅡ的表達(dá)與腫瘤的大小、組織學(xué)類均無相關(guān)性(P>0.05)。對于不同分化程度的腫瘤，其耐藥基因的表達(dá)有一定的差異。GSTπ在高分化大腸癌組織中的表達(dá)率為89.8%，明顯高于其在低分化癌中的表達(dá)率為69.2%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而LRP和TopoⅡ的陽性表達(dá)與腫瘤的分化程度無相關(guān)性(P>0.05)，見表2。表2 多藥耐藥基因與腫瘤大小、組織學(xué)類型、分化程度的相關(guān)性 2.3 多藥耐藥基因與腫瘤TNM分期的相關(guān)性 在122例大腸癌組織中LRP、GSTπ、TopoⅡ的表達(dá)與腫瘤的TNM分期、分化程度、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無相關(guān)性(P>0.05)，見表3。表3 多藥耐藥基因與腫瘤TNM分期、浸潤、轉(zhuǎn)移的相關(guān)性 3 討論 大腸癌是我國常見的惡性腫瘤之一，除手術(shù)治療外，化療是治療大腸癌的一個(gè)重要手段，可用于術(shù)后輔助治療，預(yù)防術(shù)后復(fù)發(fā)，有時(shí)也應(yīng)用于術(shù)前以提高手術(shù)切除率。然而多數(shù)大腸癌患者的化療效果并不理想，這與腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐受有關(guān)，多藥耐藥性是最為常見的原因。多藥耐藥性(multidrug drug resistance， MDR)是指腫瘤細(xì)胞不僅對一種抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥，而且可對結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同的其他抗腫瘤藥物產(chǎn)生交叉耐藥，目前已知的抗腫瘤藥物幾乎都能發(fā)生耐藥，因此認(rèn)識(shí)和克服腫瘤的多藥耐藥性具有重要臨床意義。腫瘤細(xì)胞的耐藥機(jī)制是十分復(fù)雜的，臨床表現(xiàn)為耐藥時(shí)，既可能是一種耐藥機(jī)制起作用，又可能是多種耐藥機(jī)制共同作用的結(jié)果。因此，聯(lián)合檢測多個(gè)MDR指標(biāo)，更能客觀地反映腫瘤對化療藥物的耐藥情況，并有助于化療方案的選擇及預(yù)后的判斷[2]。LRP、GSTπ、TopoⅡ均是耐藥標(biāo)志物，測定結(jié)果可間接反映大腸癌組織中MDR基因的表達(dá)。LRP和GSTπ的過度表達(dá)或活性增強(qiáng)、TopoⅡ的含量減少或活性降低均是產(chǎn)生MDR的重要機(jī)制。 肺耐藥蛋白(lung resistance protein，LRP)是近年新發(fā)現(xiàn)的與腫瘤細(xì)胞耐藥有關(guān)的蛋白分子，最早在肺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。LRP是人類主穹窿蛋白，非糖蛋白，包含869個(gè)氨基酸，蛋白分子量為110 kD，是核糖核蛋白顆粒的主要成分，由位于16號(hào)染色體短臂的LRP基因編碼[3]。LRP在多種組織腫瘤中廣泛表達(dá)，正常多表達(dá)在與外源物質(zhì)接觸并且有排泌功能的組織中，如支氣管、消化道等，而在不同的腫瘤中LRP的表達(dá)差異可反映腫瘤對化療的敏感程度，一種體外預(yù)警耐藥的指標(biāo)[4]。LRP在細(xì)胞中的表達(dá)多位于細(xì)胞漿，少部分位于核膜核孔復(fù)合體上，起到調(diào)節(jié)核及穹窿內(nèi)外的物質(zhì)分布的作用。研究發(fā)現(xiàn)，LRP主要通過調(diào)節(jié)細(xì)胞漿與細(xì)胞核之間的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，阻止藥物進(jìn)入細(xì)胞核，降低藥物分布的核質(zhì)比例產(chǎn)生耐藥，另外還可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞漿內(nèi)的囊泡運(yùn)輸而介導(dǎo)耐藥[5]。研究發(fā)現(xiàn)，LRP在腫瘤細(xì)胞中的高表達(dá)可能與長春新堿、阿霉素、順鉑等抗腫瘤藥物的耐藥有關(guān)，并且與治療效果、生存期等預(yù)后因素有負(fù)性相關(guān)。本研究結(jié)果顯示LRP在大腸癌中高表達(dá)，陽性率為88.5%，表明其在大腸癌的原發(fā)性多藥耐藥中起重要的作用，但是本次研究未發(fā)現(xiàn)LRP的表達(dá)與患者的性別、腫瘤大小及臨床分期等大腸癌的各項(xiàng)臨床病理指標(biāo)有明顯相關(guān)性，這種結(jié)果與一些文獻(xiàn)關(guān)于LRP表達(dá)與腫瘤的分化程度有相關(guān)性的報(bào)道不相符[6]，分析其原因可能與不同組織類型的腫瘤有關(guān)。大腸癌組織具有與外源物質(zhì)接觸和排泌的特點(diǎn)，這不僅是腫瘤的異質(zhì)性，而是與腫瘤的組織發(fā)生、發(fā)生部位有關(guān)。因此無論分化程度如何，腫瘤細(xì)胞均具有LRP高表達(dá)的生物學(xué)活性。本研究結(jié)果提示大腸癌中廣泛存在與LRP相關(guān)的耐藥特性，應(yīng)引起臨床的足夠重視。但由于大腸癌多以中高分化為主，對于本組病例也不除外由于樣本量的限制導(dǎo)致其結(jié)果無差異性，如加大樣本量是否能顯示其意義還有待進(jìn)一步研究。 GSTπ是一種酸性谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶，屬于谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶GST一種亞型，其最初是從人胎盤中分離出的。GSTπ是一種Ⅱ期解毒酶，在人體正常組織中廣泛表達(dá)，主要分布于參與解毒、排毒的組織中，如泌尿系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、呼吸道等，其表達(dá)在惡性腫瘤中常增高。GSTπ主要存在于胞漿中，其耐藥機(jī)制主要是：①GSTπ可以催化親電物質(zhì)烷化劑等與谷胱甘肽結(jié)合，增加藥物水溶性，使其易排除體外;②GSTπ本身可以與親脂性細(xì)胞毒藥物結(jié)合，促進(jìn)其代謝，降低抗癌藥物的細(xì)胞毒作用;③GSTπ可以還原抗癌藥物產(chǎn)生的過氧化物，使其轉(zhuǎn)變?yōu)闊o毒物質(zhì)從而介導(dǎo)耐藥;④GSTπ可以通過抑制烷化劑等親電性的化療藥物引起的癌細(xì)胞的DNA交聯(lián)，降低化療藥物對細(xì)胞的殺傷作用，可見GSTπ主要介導(dǎo)烷化劑、鉑類、絲裂霉素類等藥物的耐藥[7]。

[2] 陳慧玲. 腫瘤多藥耐藥的研究進(jìn)展[J].臨床腫瘤學(xué)雜志， 2008，13(5):475477.

[3] Scheffer GL， Wijingard PL， Flens MJ，et al.The drug resistance related protein LRP is the human major vault protein[J]. Nat Med， 1995，1(6):578582.

[4] Zquierdo MA， Scheffer GL， Flens MJ，et al.Broad distribution of the multidrug resistancerelated vault lung resistance protein in normal human tissues and tumors[J].Am J Pathol，1996，148(3):877 887.

[5] Dingemans AM，Witlox MA，Stallaert RA，et al.Expression of DNA topoisomerase II alpha and topoisomerase Iibeta genes predicts survival and response to chemotherapy in patients with small cell lung cancer. Clin Cancer Res，1999，5 (8):20482058.

[6] 鄭少江，吳煥明，王偉.LRP、TopoⅡ在非小細(xì)胞癌肺癌中的協(xié)同表達(dá)及其臨床意義[J].中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2004， 13(2): 180183.

[7] 張燕，金先慶， 趙珍珍，等.5種耐藥基因在成人常見惡性腫瘤中的表達(dá)特點(diǎn)[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，32(10)：10231027.

[8] Ranganathan S ， Tew KD.Immunohistochemical localization of glutathione Stransferases alpha ，mu ，and pi in normal tissue and carcinomad from human colon[J].Carcinogenesis， 1991， 12:2383.

[9] Volm M， Matten J.Expresson of several resistant mechanisms in untreated human kidney and lung carcinomas[J]. Anticancer Research， 1992，12:10631068.

[10] 陸芹，吳德明， 管惟苓.Pgp、TopoⅡ和GSTπ在大腸癌中的表達(dá)及其意義[J].江蘇醫(yī)藥雜志，2002， 28(1)：811.