【摘要】 目的 分析我院新生兒科病區產ESBLs、AmpC酶的肺炎克雷伯菌的耐藥情況，指導臨床合理用藥。方法 按CLSI 推薦的超廣譜β內酰胺酶( ESBLs)確證試驗，對肺炎克雷伯菌進行ESBLs檢測，并用三維試驗法、三維試驗抑制試驗進行AmpC酶檢測。結果 160株肺炎克雷伯菌中，檢到產ESBLs肺炎克雷伯菌84株，陽性率高達52.50%。71株耐頭孢西丁菌株檢到23株產AmpC酶，其中單產AmpC酶5株，產Ampc+ESBLs菌株18株。AmpC酶陽性率為14.38%(23/160)。結論 分離自我院新生兒科的肺炎克雷伯菌對β-內酰胺類抗菌藥物耐藥嚴重，主要以產ESBLs和(或)AmpC酶為主。給臨床抗感染治療帶來很大困難，是院內感染的一大隱患。

【關鍵詞】 超廣譜β-內酰胺酶 AmpC酶 肺炎克雷伯菌 三維試驗 三維抑制試驗

AmpC酶是繼ESBLs之后，臨床上出現的腸桿菌科細菌的又一重要耐藥機制，肺炎克雷伯菌作為條件致病菌是新生兒感染性肺炎的常見病原菌，也是重要的院內感染病原菌，在醫院感染分離率一直趨于首位。近年來，由于廣譜抗菌藥物的廣泛大量應用，導致這些細菌出現高產AmpC酶菌株。近年來，編碼AmpC酶的基因已轉移到質粒上，并在大腸埃希菌及肺炎克雷伯菌中出現[1]，易在不同菌種間橫向播散。所以監測和檢測這類細菌產ESBLs和AmpC酶的情況，對指導臨床合理使用抗菌藥物以及預防和控制院內感染的發生具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 肺炎克雷伯菌160株均分離自2008年1月至2008年12月我院新生兒病區患兒呼吸道標本。

1.1.2 一次性培養皿與藥敏紙片 一次性培養皿為鄭州博賽產品;藥敏紙片為英國OXOID公司產品。

1.1.3 試劑 克拉維酸(中國藥品生物制品檢定所);鄰氯西林(上海四藥有限公司)。

1.1.4 質控菌株 E.coli ATCC25922，K.pneumoniae ATCC700603，E.cloacae 029，E.cloacae 029M。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗 按CLSI推薦的K-B紙片法進行測定，并按其制定的標準進行判讀。

1.2.2 超廣譜β-內酰胺酶( ESBLs) 檢測 按CLSI推薦的確證試驗測定ESBLs。

1.2.3 產AmpC酶菌株初篩 采用K-B法，按照CLSI推薦的方法進行[2]，頭孢西丁(30μg/片)抑菌環直徑≤17mm時，提示對FOX中介或耐藥為疑產AmpC酶菌株。

1.2.4 β-內酰胺酶粗提取物的制備 取50μl0.5麥氏單位菌液加入12ml胰蛋白胨肉湯中，35℃恒溫搖床孵育6h，4000r/min，4℃離心20min，棄上清，將沉淀物-70℃反復凍融5次，加入pH 7.0的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液1.2ml混勻，14000r/min，4℃離心20min，取上清液即為酶粗提物，無菌試驗后-20℃保存。

1.2.5 三維試驗 對可疑菌株的酶提取物用頭孢西丁三維試驗方法進行AmpC 酶確證。

1.2.6 三維試驗抑制試驗[3] 在涂有E.coli ATCC25922 菌液的M-H平皿中央貼1片30μg頭孢曲松紙片，垂直挖四個狹縫，分別加入40μl的試驗菌株酶粗提取物、36μl酶粗提取物+4μl 2mmol/L鄰氯西林、36μl酶粗提取物+4μl 2mmol/L克拉維酸、36μl酶粗提取物+4μl 2mmol/L克拉維酸+4μl 2mmol/L鄰氯西林，35℃培養24h，擴大生長區域消失為酶抑制實驗陽性。

2 結果

2.1 160株肺炎克雷伯菌耐藥現象較為嚴重，對16種抗菌藥物中的13種均出現不同程度的耐藥，其中對青霉素類、一代至四代頭孢菌素的耐藥率均超過60% ，經ESBLs確證試驗測定產ESBLs有84株，陽性率高達52.50%。對加酶抑制劑的β內酰胺類復合制劑舒普深、特治星的敏感率僅為55.06%、56.05%，頭霉素類的頭孢西丁敏感率僅為55.63%，應引起臨床重視。尚未出現對碳青酶烯類耐藥的肺炎克雷伯菌菌株。

2.2 經產AmpC酶菌株初篩試驗檢出可疑產AmpC酶細菌71株，經頭孢西丁三維試驗方法確證產AmpC酶細菌5株。經三維抑制試驗確證單產AmpC酶菌株5株(與三維試驗相符)，單產ESBLs菌株84株(與ESBLs紙片確證試驗相符)。同時產Ampc+ESBLs菌株18株，即產超超廣譜β內酰胺酶(SSBLs)，耐藥情況非常嚴重，對β-內酰胺類抗菌藥物(包括含酶抑制劑的復合制劑)全部耐藥，氨基糖苷類、喹諾酮類耐藥率也有所提高，僅碳青酶烯類未出現耐藥。

3 討論

超廣譜β內酰胺酶(ESBLs)屬于Bush分類2be亞組，分子分類中屬于A類酶，ESBLs是目前腸桿菌科細菌(尤其是肺炎克雷伯菌)對廣譜頭孢菌素產生耐藥的最主要原因，它由質粒介導，可使細菌對青霉素和一、二、三、四代頭孢菌素以及單環菌素耐藥，但對頭霉素、碳青酶烯類及酶抑制劑(克拉維酸)敏感。

AmpCβ內酰胺酶是由革蘭氏陰性桿菌產生的主要由染色體介導的絲氨酸頭孢菌素酶組成的一個酶家族，屬于Bush分類中的Ⅰ組(C類)，能水解三代頭孢，不被β內酰胺酶抑制劑克拉維酸所抑制。研究表明:β-內酰胺類抗菌藥物頭孢西丁和碳青酶烯抗菌藥物亞胺培南是強有力的AmpC酶誘導劑[4]。如果用頭孢西丁或頭孢西丁聯合第三代頭孢菌素治療含有ampC基因的腸桿菌科細菌如肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌，那么在治療過程中會因為AmpC酶的大量產生而導致治療失敗。理論上講，四代頭孢對產AmpC酶菌株敏感，但如果同時產ESBLs則四代頭孢也將無效。

實驗結果顯示，我院新生兒病區分離出的160株肺炎克雷伯菌耐藥情況十分嚴重，僅對阿米卡星、亞胺培南、美羅培南尚未出現耐藥，其他16種抗菌藥物均出現不同程度的耐藥，其中對新生兒適用的β-內酰胺類抗菌藥物耐藥嚴重，一代至四代頭孢菌素耐藥率均超過60%，舒普深、特治星敏感率也僅有55.06%和56.05%。產超超廣譜β內酰胺酶(SSBLs)的肺炎克雷伯菌檢出率高達11.25%(18/160)，針對這類細菌臨床用藥唯有選用亞胺培南、美羅培南，抗菌藥物可選范圍之局限令人擔憂。

由于臨床大量廣泛使用三代頭孢、亞胺培南、美羅培南，在抗菌藥物的選擇壓力下我院新生兒科已篩選出持續高產型AmpC酶菌株，一旦處理不當，將持續在醫院環境內擴散。如果進一步出現質粒介導的AmpC酶菌株[5]，則對院內感染將造成嚴重的威脅。因此，規范臨床合理使用高級抗菌藥物的任務已迫在眉睫。《抗菌藥物臨床應用指導原則》[6]規定，碳青酶烯類藥物不宜用于治療輕癥感染，更不可作為預防用藥。因此臨床對懷疑細菌感染性肺炎的經驗性用藥或預防性用藥應盡量避免碳青酶烯類的使用!