【摘要】 目的 深入腸球菌耐藥性的產生機制，指導臨床合理用藥。 采用一步誘導法，對8株糞腸球菌、2株屎腸球菌和9株糞腸球菌、1株屎腸球菌進行四環素和左氧氟沙星誘導性耐藥試驗。對誘導出的菌株用瓊脂稀釋法測定藥物敏感性；用PCR法檢測四環素耐藥基因tetM、tetL，用PCR法擴增gyrA、parC基因后測定DNA序列。結果 10株實驗菌中的2株誘導產生了多株穩定的四環素耐藥株。耐藥株的MIC分別為16～128μg/ml，與原株（MIC0.25μg/ml、2μg/ml）比較，增加了16～512倍。在1株實驗菌的誘導耐藥株的質粒DNA上檢測到tetL耐藥基因，另一株實驗菌株的誘導耐藥株的染色體DNA上檢測到tetM耐藥基因；10株實驗菌中的2株誘導產生了多株穩定的左氧氟沙星耐藥株。誘導耐藥株的MIC分別為16～64μg/ml，與原株（MIC 2μg/ml、2μg/ml）比較，增加了8～32倍。GyrA的QRDR內的第87位或第83位的氨基酸及ParC的 QRDR內的第80位的氨基酸均發生了改變。結論 一步法抗菌藥物誘導性耐藥試驗的結果表明，腸球菌可在高于耐藥MIC濃度的抗菌藥物短期作用后獲得耐藥性。

【關鍵詞】 腸球菌 抗菌藥物 誘導性耐藥 抗菌藥物壓力

Laboratory study of antibacterial agents on enterococcus induced resistance

【Abstract】 Objective purpose of the present research was to study on the emergence mechanism of enterococcal resistance to a variety of antibacterial agents，and to guide the selection and use of antimicrobial agents in clinical practice.Methods Eight of faecalis enterococcus and two of faecalis enterococcus，nine of faecalis enterococcus and one of faecium enterococcus were selected to performed experiments on induced resistance to tetracycline、levofloxacin respectively by one-step method.The susceptibility of the induced strains resisitant to tetracycline、levofloxacin was measured by determining the MIC using agar dilution method. The tetM and tetL gene in the induced strains were detected by PCR， gyrA and parC gene were amplified by using PCR，then the nucleotide sequence of two genes were analysed.Results Some strains stably resistant to tetracycline were obtained from 2 of 10 test strains，the MICs of these laboratory resistant strains were 16～128μg/ml.with 16-fold～512-fold increase compared with parental strains (MIC 0.25μg/ml、2μg/ml， respectively). The gene of tetL was detected in the plasmid DNA of one test strain and its laboratory resistant strains. The gene of tetM was detected in the chromosome DNA of the laboratory resistant strains from another one test strain. Some strains stably resistant to levofloxacin were obtained from 2 of 10 test strains.The MICs of the laboratory stains were 16～64μg/ml，with 8～32 times higher than that of the parental strains (MIC 2μg/ml、2μg/ml respectively). Neucleotide sequence analysis and comparison of the derived amino acid sequence revealed that GyrA had a substitution at position 83 and 87 in laboratory resistant strains.The alterations in ParC at position 80 were observed in all laboratory resistant strains.Conclusion The results of in vitro experiments on enterococcal strains for induced resistance to tetracycline and levofloxacin， were performed by one-step method，show that acquired resistance could be occurred when exposuring them to high level of some antibacterial agents for short term.

【Key words】 enterococcus antibacterial agents induced resistance antibacterial pressure

近年來，腸球菌作為一種引起感染的重要病原菌已經引起了醫學界的廣泛關注。美國醫院感染監視系統(NISS)已將其列為引起醫院感染的第二大病原菌［1］。

腸球菌不僅具有天然耐藥性，而且更易被誘導產生新的耐藥性。Tankovic報告對環丙沙星耐藥的腸球菌由1987～1989年期間的不到2%增加到1991～1993年間的14%以上，而且是由該類藥物在臨床上的增加所致［2］。在瑞典Huddinge醫院，對喹諾酮耐藥的腸球菌由1994年的11%增加到1997年的25%［3］。而國內1997～2001年期間臨床分離的腸球菌對環丙沙星耐藥率分別為糞腸球菌44.2%，屎腸球菌70.7%［4］。在美國，由于萬古霉素的使用，1989～1993年間腸球菌對萬古霉素的耐藥率增加了20倍。這些統計學臨床資料已經顯示，抗菌藥物的臨床應用造成的藥物選擇性壓力可能是引起腸球菌耐藥性的產生與擴散的重要原因之一。

為深入探索腸球菌耐藥性的產生和，本課題就此進行了部分抗菌藥物的實驗研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 實驗菌株TE1～TE10（TE3、TE9為屎腸球菌，其它為糞腸球菌）用于四環素誘導性耐藥試驗。實驗菌株LE1～LE10（LE2為屎腸球菌，其它為糞腸球菌）用于左氧氟沙星誘導性耐藥試驗。質控菌株為糞腸球菌ATCC29212、糞腸球菌ATCC 51299。

1.1.2 抗菌藥物 左氧氟沙星（LEV，5μg/片）、四環素(TCY，30μg/片)藥敏紙片購自Oxoid公司。四環素、左氧氟沙星粉劑購自生物制品研究所。

1.1.3 試劑 心腦浸液、M-H瓊脂，購自BECTON-DICKINSON公司。Vitek細菌鑒定卡及藥敏鑒定卡購自法國生物梅里埃公司。PCR引物由賽百盛公司合成。四環素耐藥基因tetM引物為5′-GAC ACG CCA GGA CAT ATG G-3′， 5′-TGC TTT CCT CTT GTT CGA G-3′；四環素耐藥基因tetL引物為5′-ATA AAT TGT TTC GGG TCG TTA AT-3′，5′-AAC CAG CCA ACT AAT GAC AAT GAT-3′；DNA消旋酶gyrA引物為5′-CGG GAT GAA CGA ATT GGG TGT GA-3′，5′-AAT TTTACT CAT ACG TGC TTC GG-3′；DNA消旋酶parC引物為5′-AAA CCT GTT CAG CGC CGC AT-3′，5′-TCG GTG TAA CGC ATT GCC GC-3′。

1.1.4 儀器設備 Vitek AMS-60全自動細菌鑒定及藥敏系統（法國生物梅里埃公司）。AG-9600 AMPLISENSOR MINILYZER PCR擴增儀（美國）。

1.2 方法

1.2.1 實驗菌株的選擇 依據細菌鑒定及MIC結果，最終選擇對四環素敏感的8株糞腸球菌和2株屎腸球菌（MIC 0.25～4μg/ml）作為四環素誘導性耐藥的實驗菌株；對左氧氟沙星敏感的9株糞腸球菌和1株屎腸球菌（MIC 0.5～2μg/ml）作為左氧氟沙星誘導性耐藥實驗菌株。

1.2.2 藥物敏感性試驗 瓊脂稀釋法參照2002年NCCLS推薦的方法進行操作及判讀結果，同時測定糞腸球菌ATCC29212、糞腸球菌ATCC 51299的MIC進行質控。

1.2.3 四環素誘導性耐藥試驗 采用一步法。參照［5］及腸球菌對四環素耐藥的MIC界值，首先確定四環素誘導耐藥試驗的藥物濃度為20μg/ml、細菌接種量為107CFU/每個平板。將實驗菌制備成1×108CFU/ml菌懸液，取100μl菌懸液加入到含20μg/ml四環素的BHI瓊脂平板上，用無菌L形棒均勻涂布平板，35℃培養24h、48h、72h、96h、120h后觀察結果，并記錄生長的菌落數。取培養后生長出的菌落，純培養后制備1×108CFU/ml菌懸液，取100μl菌懸液涂布接種新鮮制備的含20μg/ml四環素的BHI瓊脂平板，35℃培養18～24h，觀察有無細菌生長。在新鮮制備的及35℃分別放置了24、48、72、96和120h的含20μg/ml四環素的BHI瓊脂平板上，涂布接種100μl 1×108CFU/ml糞腸球菌ATCC29212及實驗菌懸液，于35℃培養18～24h后觀察有無菌落生長。對誘導出的菌株用瓊脂稀釋法測定藥物敏感性，用PCR檢測tetL和tetM耐藥基因。

1.2.4 左氧氟沙星誘導性耐藥試驗 采用一步法。參照四環素誘導性耐藥試驗，首先確定左氧氟沙星誘導耐藥試驗的藥物濃度為10μg/ml。其余步驟基本同四環素誘導性耐藥試驗。此外，對部分誘導出的菌株的gyrA和parC基因擴增后，進行DNA序列。

1.2.5 誘導性耐藥菌株的穩定性試驗 將誘導的耐藥菌接種在無抗菌藥物BHI肉湯中，35℃培養，每24h轉種一次，連續培養10代。然后進行藥物敏感性測定。

1.2.6 耐藥基因測定 堿裂解法制備質粒DNA、參照方法［6］制備染色體DNA。PCR反應體系100μl，含模板DNA約0.2μg，引物0.2μmol/L，0.2mmol/L dNTP，10mmol/L Tris-HCl，50mmol/L KCl，2.5mmol/L MgCl2，2.5U TaqDNA聚合酶。耐藥基因DNA測序：將g