作者：張文平張文書王小麗張瑞其黃真

【摘要】 目的應用血清藥理學方法研究中藥千里光抗金黃色葡萄球菌的作用及其機制。方法從千里光中分離出黃酮類化合物，然后通過給小鼠灌胃制備千里光水浸液的含藥血清和黃酮類化合物的含藥血清。用掃描電鏡觀察各含藥血清對金黃色葡萄球菌超微結(jié)構(gòu)的影響，用同位素前體參入試驗觀察各含藥血清對金黃色葡萄球菌生物合成的影響。同時設立生理鹽水血清作為陰性對照。結(jié)果與陰性對照血清相比，兩種含藥血清作用后的金黃色葡萄球菌，其形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)均發(fā)生明顯的變化，菌體塌陷，細菌融合成團，呈現(xiàn)腫脹模糊等變化；其DNA ，RNA 蛋白質(zhì)和肽聚糖合成也均受到明顯的抑制。結(jié)論千里光的抗金黃色葡萄球菌作用機制可能是通過抑制細菌的DNA，RNA，蛋白質(zhì)和肽聚糖的合成有關(guān)，其作用的有效成分可能是黃酮類化合物。

【關(guān)鍵詞】 千里光；金黃色葡萄球菌；掃描電鏡；同位素參入；藥物作用； 血清藥理學

Abstract：ObjectiveTo explore the antibacterial mechanism of Senecio scandens Buch-Ham(SSB) on Staphylococcus aureus by serum pharmacological method．MethodsFlavonoid compound was isolated from SSB， and then the serum contained water decoct agent of SSB or flavonoid compound were prepared with mice. By scanning electronic microscope (SEM)， the effects of drug-containing serum on the ultrastructure of S. aureus were observed. By incorporation experiment of isotope-labeled precursor， the effects of drug containing serum on the biosynthesis of S. aureus were observed as well. Meanwhile， the serum contained normal saline was set as negative control.ResultsCompared with negative control serum， the morphology and ultrastructure of both drug containing serum on S. aureus showed obvious changes :the cell collapsed， melt together， blurred and swollen， ect. In addition， the synthesis of DNA， RNA， protein and peptidoglycan was inhibited.ConclusionThe antibacterial mechanism of SSB on S. aureus may be involved with the inhibition of DNA， RNA， protein and peptidoglycan synthesis， its effective ingredients may be flavonoid compound.

Key words：Senecio scandens Buch-Ham; Staphylococcus aureus; Scanning electronic microscope; Isotope-incorporation; Drug action; Serum pharmacology 千里光Senecio scandens Buch-Ham系菊科千里光屬植物，我國南方各省均有分布。該藥性涼味苦，具有清熱解毒、消炎涼血、明目止痛、去腐生肌之功效，民間廣泛用于治療各種炎癥和皮膚病。其化學成分主要有黃酮及其苷類、鞣質(zhì)、生物堿等。現(xiàn)代藥理實驗表明［1，2］千里光及其含藥血清對金黃色葡萄球菌等多種細菌均有較強的抗菌作用，黃酮類化合物可能是千里光的主要抗菌有效成分。為了進一步研究千里光的抗菌機制，本研究采用血清藥理學方法，以常用的金黃色葡萄球菌為研究對象，結(jié)合電鏡技術(shù)、同位素參入技術(shù)等觀察了千里光及其黃酮類化合物對受試菌超微結(jié)構(gòu)以及DNA、RNA、蛋白質(zhì)和肽聚糖等生物合成的影響。現(xiàn)報道如下。

1 材料

1.1 菌株

金黃色葡萄球菌(47-1800Ａ+)購于中國藥品生物制品檢定所。

1.2 藥物和試劑

千里光購于江西贛南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院中藥房；同位素標記前體3H-TdR，3H-UdR，3H-亮氨酸，3H-葡糖胺購于中國科學院上海核技術(shù)開發(fā)公司。

1.3 動物

BALB/c近交系小鼠，雌雄兼用，體重（20±2）g，由江西省實驗動物中心提供。

2 方法

2.1 千里光總黃酮的提取

千里光全草切成小段，以體積分數(shù)為95％乙醇回流提取3次，提取液合并后減壓濃縮除去乙醇，水溶液以50 mg/ml 碳酸鈉處理后以氯仿萃取3次，堿水層以1 mol/ L HCl酸化至pH為2后以醋酸乙酯萃取3次，水洗至中性，醋酸乙酯層濃縮成浸膏即得千里光總黃酮。

2.2 含藥血清的制備

2.2.1 千里光水浸液含藥血清的制備

取干燥生藥加適量水煮沸30 min，過濾藥渣再加水煮沸30 min，過濾，合并兩次濾液，濃縮得1g/ml千里光水煎劑。將上述水煎劑按40 g/kg給予小鼠灌胃給藥，2次/d，共5次，未次給藥后2 h，分離血清，制備千里光含藥血清［2］，使用前用MH肉湯稀釋。

2.2.2 千里光總黃酮含藥血清的制備

將千里光總黃酮經(jīng)NS稀釋后按200 mg/ kg給予試驗動物灌注，灌注時間及采集方式同“2.2.1”項，制備千里光總黃酮含藥血清。

2.2.3 陰性對照血清制備

用生理鹽水替代藥物灌注動物，灌注時間及采集方式同“2.2.1”項，采集血清作為陰性對照。

2.3 菌液的制備

取儲藏菌少許接種于MH瓊脂平板，35℃培養(yǎng)24 h使菌種活化。次日取一接種環(huán)活化菌接種于1 ml MH肉湯培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)6～8 h，再取菌液0.1 ml，加入液體培養(yǎng)基至100 ml，稀釋1 000倍，調(diào)配菌液濃度為5×105CFU/ml。

2.4 含藥血清體外抑菌實驗

將稀釋1 000倍的菌液各取0.1 ml分別加入含藥血清各稀釋管中，置35℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，觀察各管的變化。如試管出現(xiàn)混濁，表明有菌生長，含藥血清無抑菌作用；如試管澄清，則表明無菌生長，含藥血清有抑菌作用，以含藥量低而肉眼看不見細菌生長的那一管的含藥量為藥物對該菌種的最低抑菌濃度(MIC)。實驗重復3次。

2.5 同位素前體參入實驗［3］

3種受試血清均以1 MIC藥物濃度作用于對數(shù)生長期的試驗菌，均以3H-TdR、3H-UdR、3H-亮氨酸和3H-葡糖胺 (終末濃度為均為0.5 μCi/ml)進行同位素前體參入試驗。在無菌的96孔細胞培養(yǎng)板孔中依次加入90.0 μl的藥物(空白對照組用生理鹽水代替藥物)，100.0 μl的菌液及10.0 μl的同位素前體物質(zhì)，每個藥物濃度均設3個平行孔，然后置35℃振蕩培養(yǎng)30 min。用多頭細胞收集儀收集，將樣品吸附在49型玻纖濾紙上，烘干后于液體閃爍計數(shù)器(Beckman LS-5000TA)上進行β計數(shù)，測出每分脈沖數(shù)（cpm），實驗重復3次。將試驗組和對照組的cpm值進行比較，并按公式計算參入抑制率。參入抑制率（%）=〔(空白對照組cpm均值-試驗組cpm均值)/空白對照組cpm均值〕×100%

2.6 電鏡觀察［4］

將3種受試血清均以1 MIC藥物濃度作用于對數(shù)生長期的試驗菌，作用8 h后離心收集菌體，將菌體浸入3%戊二醛中，4℃固定至少2 h，丙酮逐級脫水，醋酸異戊脂置換，臨界點干燥，金屬鍍膜置S-570掃描電鏡(日本，日立公司)下觀察。

3 結(jié)果

3.1 含藥血清體外抑菌實驗

千里光水浸液、千里光總黃酮含藥血清以及陰性對照血清對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度(滴度)分別為0.2，0.6，1.0。

3.2 同位素前體參入實驗

3個含藥血清組的cpm值均較空白對照組相應的cpm值明顯減少，但千里光水浸液含藥血清組和千里光總黃酮含藥血清組與空白對照組比較差異均有顯著性；千里光水浸液含藥血清組和千里光總黃酮含藥血清組對4種同位素參入的抑制率均明顯高于相應陰性對照血清組 (P<0.01)，而千里光水浸液含藥血清組和千里光總黃酮含藥血清組對4種同位素的參入抑制率無明顯差異(P>0.05)。結(jié)果見表1。表1 3組含藥血清對同位素前體參入金黃色葡萄球菌的影響（略）

3.3 掃描電鏡觀察

正常的金黃色葡萄球菌細胞表面光滑、圓潤，呈球形，大小和形狀一致，細胞與細胞間界限分明，葡萄狀排列。經(jīng)千里光水浸液含藥血清和千里光總黃酮含藥血清作用后，多數(shù)金黃色葡萄球菌的菌體結(jié)構(gòu)被破壞，菌體塌陷，細菌融合成團，呈現(xiàn)腫脹模糊等變化，而經(jīng)陰性對照血清作用后，菌體結(jié)構(gòu)變化不明顯。

4 討論

血清藥理學方法是指動物經(jīng)口服給藥后采集含藥血清進行體外實驗的一種方法，它在某種程度上克服了中藥制劑本身的理化性質(zhì)等不確定因素的干擾，不僅能反映中藥及其代謝產(chǎn)物的藥理作用，而且能反映可能由藥物誘導機體內(nèi)源性成分所產(chǎn)生的作用，更接近藥物在體內(nèi)環(huán)境產(chǎn)生的真實過程。該方法現(xiàn)已成為中藥體外藥效學研究的一種重要手段［5］。 千里光為臨床常用的一種抗菌中藥，但其抗菌作用機制不明。本研究首次采用血清藥理學方法，結(jié)合電鏡技術(shù)和同位素參入技術(shù)研究千里光及其有效成分—黃酮類化合物抗金黃色葡萄球菌的作用機制。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)經(jīng)千里光水浸液和千里光總黃酮含藥血清作用后，金黃色葡萄球的形態(tài)發(fā)生了明顯變化，而陰性對照組血清作用后金黃色葡萄球的形態(tài)變化不明顯，說明含藥血清對試驗菌的細胞壁和細胞膜具有一定破壞作用，而細胞壁和細胞膜一旦被破壞，其細菌細胞就不能維持細胞固有形態(tài)，胞內(nèi)外物質(zhì)交換受阻，結(jié)合于胞膜上的各種酶不能正常發(fā)揮作用，導致菌細胞對營養(yǎng)物質(zhì)吸收降低、生物大分子合成受阻［6］。結(jié)合同位素標記參入實驗結(jié)果也證實了這一點。TdR、UdR、亮氨酸和葡糖胺分別作為DNA、RNA、蛋白質(zhì)、肽聚糖生物合成的前體物質(zhì)，以其同位素標記物進行同位素參入實驗，可充分反映細菌生物大分子的合成代謝情況。本研究的參入實驗結(jié)果顯示千里光水浸液和千里光總黃酮含藥血清對4 種同位素的參入有明顯抑制作用，以對3H-UdR的參入抑制率最高，達80%以上，對3H-TdR、3H-亮氨酸和3H-葡糖胺的參入抑制率在60%～75%。上述結(jié)果提示千里光的抗菌機制可能是通過抑制金黃色葡萄球菌的DNA、RNA、蛋白質(zhì)和肽聚糖的合成而表現(xiàn)抑菌和殺菌作用，其作用的有效成分與黃酮類化合物有關(guān)，這與文獻報道黃酮類化合物是一類有抗菌作用成分一致［7］，但其確切機制有待進一步研究。