【關鍵詞】 DNA修復； DNAPK抑制劑； 腫瘤； 放療增敏

目前在研究有關腫瘤細胞對放療敏感性方面，DNA修復蛋白的抑制劑是一個熱點。在修復DNA的蛋白中，DNA依賴的蛋白激酶(DNAPK)參與了多細胞生物的非同源末端連接（NHEJ）過程，能保護由于電離輻射所致雙鏈DNA被破壞的細胞，所以它的特異性抑制劑作為放療增敏劑倍受關注。本文就DNA損傷修復的機制及DNAPK抑制物的生物學特性進行闡述。

1 概述

為提高腫瘤患者的生存率，應不斷選擇毒副作用盡量小的綜合治療方法。尋找能有效抑制DNA損傷修復的因子以運用到放療增敏中，是目前研究的一熱點。DNA損傷觸發各種細胞應答，其中包括DNA的自我修復，途徑有逆轉，切除或再結合等，可以多種途徑共同參與。研究表明，對放療不敏感的腫瘤細胞，其DNA具有很強的修復活性。據此制藥公司一直著手于對DNA修復抑制劑的開發。

但DNA修復抑制劑可引起不良反應。因DNA修復是正常細胞的生理現象，參與基因穩定性的維持，其活性被抑制可導致堿基錯配修復或核苷剪切修復能力的下降，引發正常組織惡變，因此將DNA修復活性作為藥理學靶點時必須仔細研究其修復機制及參與反應的關鍵蛋白，以助評估潛在副作用如細胞毒性或癌變，并設計特異性強的抑制劑。

在各種DNA修復途經中，具有兩個臨床應用價值：(1) 由O6烷基鳥嘌呤甲基轉移酶(AGT)所參與的O6烷基鳥嘌呤的逆轉機制[1]；(2) 主要通過非同源末端連接（NHEJ）途經的雙鏈損傷修復機制[2]。在哺乳動物細胞中NHEJ途徑需要一些因子的參與，其中DNA依賴的蛋白激酶（DNAPK）是參與雙鏈損傷修復的修復復合體的基本組成成分。本文主要討論DNAPK作為一個藥理學靶點的相關內容、其抑制劑的生物學特性以及增加細胞對放療敏感性的影響。

2 NHEJ途徑中的雙鏈損傷修復復合體DNAPK

當DNA雙鏈受到損傷時，細胞將通過不同的途經啟動應答克服損傷進行修復。盡管同源性重組修復可恢復DNA鏈的連續性，但哺乳動物細胞中NHEJ途徑在雙鏈損傷修復過程中起主要作用。NHEJ主要依賴6個核心因子包括：Ku70、Ku80、DNAPKcs、XRCC4、連接酶IV和Artemis[3，4]。而DNAPK這個絲/蘇氨酸激酶，正是包括催化亞單位DNAPKcs和調節亞單位Ku蛋白兩部分的復合物，它通過激活后的構像改變[5]，產生生物學效應。DNAPKcs是由4127個氨基酸組成的相對分子質量約470000的大分子量蛋白質，其基因位于8q11。其C末端結構域和參與信號傳導的磷脂酰肌醇激酶3(PI3K)有同源性，故屬PIKK（PI3K樣激酶）家族，其靠近激酶活性區的 30023850位氨基酸處是與ku蛋白相互作用的部位，細胞凋亡時DNAPKcs在肽鏈中間部位斷裂而失活；Ku蛋白是一種自身抗原，由2條多肽鏈緊密結合在一起形成異二聚體結構，兩條肽鏈分別稱Ku70和Ku80。人Ku70基因位于22q13，編碼609個氨基酸，相對分子質量約69000；Ku80基因位于2q3334，編碼732個氨基酸，相對分子質量約83000。雙鏈損傷(DSBs)修復時，2個Ku分子通過一個預先形成的通道特異性地連接到雙鏈損傷處，分別識別并結合于每一條DNA鏈末端，然后以ATP依賴的方式沿DNA鏈分別向兩端滑動一小段距離，同時Ku本身所具有的弱解旋酶活性使2個斷端局部解鏈。從而形成KuDNA復合物吸引DNAPKcs到損傷部位[4]，與之結合并激活其絲/蘇氨酸激酶活性，磷酸化參與修復及損傷信號傳導的一系列蛋白質，如斷端經核酸外切酶修剪、DNA聚合酶填充等，還需通過另一復合物即異二聚物XRCC4/連接酶IV的幫助[6]，其參與DNA斷裂再接的過程；而蛋白Artemis則在發夾末端受損時起一定作用。綜上可見，核心因子DNAPK聯合其他因子共同參與了NHEJ過程。最終當DNA鏈一旦連接起來，DNAPK即發生自身磷酸化，使2個亞單位從DNA鏈上解離。另有研究發現，DNAPK在維持染色體末端端粒的穩定性及防止染色體端端融合等方面起作用。

3 DNAPK的激酶活性

DNAPKcs具較弱蛋白激酶活性[7]，當DNAPKcs經由Ku/DNA 復合物介導催化后，激酶活性大大增強。雖在其他序列中絲/蘇氨酸結構也可發生磷酸化，但一般發生在S/TQ結構。雖尚未發現DNAPK對翻譯后的修飾起作用，但它可將體外的Ku和細胞內的XRCC4磷酸化，體外試驗也已證實Artemis一旦被磷酸化則將改變其核酶活性。DNAPKcs在細胞經受放療后會發生自身（包含40個氨基酸的區域和其他位點）磷酸化并被激活[8]，與Ku解離，這樣DNA雙鏈損傷修復的后續加工處理和連接步驟才能繼續進行[8]。有模型研究發現[9，10]，DNAPKcsC端自身磷酸化可使DNA末端發生自身磷酸化，使完成修復任務的DNAPK從DNA末端分離下來。業已表明DNAPKcs抑制劑可阻礙DNAPK結合在DNA的末端，阻止DNA末端的處理。自身磷酸化是細胞內雙鏈損傷修復過程的關鍵。在細胞內，DNAPK抑制劑在雙鏈損傷修復過程中不單阻止NHEJ，也阻礙同源重組，這更體現抑制劑作為放療增敏劑所具有的潛在作用[11]。

4 DNAPK 是藥理學靶點

基于DNAPK的表達或活性的增減與腫瘤細胞對放療敏感性之間的關系密切，DNAPK作為一個藥理學新靶點，DNA修復抑制劑得到廣泛研究。細胞突變時，DNAPK表達缺乏導致對放射性藥物或電離放射的敏感性增加[2]。類似地，反義或siRNA轉染后DNAPKcs或Ku表達的下降也可導致對雙鏈損傷誘導劑的敏感性增加[12]。Dongmei Lu等［13］利用siRNA的方法敲除DNAPK的基因，可以抑制TNF介導的Akt及PKCε的磷酸化，加速細胞凋亡，表明PKCε活化Akt需通過DNAPK抗凋亡，且DNAPK可以從Akt開始調節受體激酶凋亡。來源于遲發性放射壞死病人的兩個細胞系對雙鏈損傷修復能力的下降與DNAPK活性的下降呈正比[14]。Tonotsuka等[15]檢測食管癌Ku70、Ku80 以及DNAPKcs的表達，發現這些蛋白的表達較對照組癌旁正常組織都明顯增高，而腫瘤內各部分DNA－PK表達的不均一，與腫瘤的進展與分化水平有關。另外，DNAPK下調可使細胞對低劑量的放療具有敏感性，這體現了它在細胞對低劑量放射（下降0.5Gy）進行應答的重要作用，使得DNAPK成為一個很具吸引力的靶分子。

5 DNAPK的抑制劑

目前發現，可通過降低蛋白的表達，抑制修復復合體的聚合及拮抗激酶活性等方法抑制DNAPK活性。已設計出對抗Ku或者DNAPKcs的反義寡核苷酸，它可使蛋白表達降低。DNAPK結合到DNA末端這個過程怎樣被抑制的呢？Ku是一種含量豐富的核蛋白，具有與DNA末端結合的主要活性，但因結構的原因缺乏與DNA末端結合的特異性位點，因此抑制Ku與DNA末端的結合并非理想靶點；相反DNAPKcs與Ku的聚合是通過與Ku80的C末端（720932個氨基酸）之間的相互作用而完成，如將外周淋巴細胞中的Ku80切除一端（C末端），剩余部分與Ku70形成一有功能的異二聚體，它能與DNA結合但不能激活DNAPK的酶活性，這種能阻止DNAPKcs與Ku結合的目標肽，是一種以肽為基礎的DNAPK抑制劑，可抑制雙鏈損傷修復活性，增加細胞對放療敏感性[16]。

研究主要目標是確定能抑制DNAPK激酶活性的小分子。因DNAPK與PI3K具同源性，故可推測PI3K抑制物的衍生物可抑制DNAPK及雙鏈損傷信號激酶。DNAPK抑制劑渥曼青霉素（wortmannin）是ATP非競爭性抑制劑，能與DNAPKcs及其他PIKK家族成員激酶的ATP結合位點共價結合。PI3K在細胞質中的IC50是2～3nm，而DNAPK的IC50超過其100倍。體內有效渥曼青霉素濃度過高，且渥曼青霉素水溶性差，在水溶性溶劑中的穩定性也差，限制了其臨床應用性。

一種更有效的人工合成槲皮素衍生物，2(4嗎啉基)8苯基4H苯并吡喃4one( LY294002)，作為DNAPK上ATP的競爭者在抑制DNAPK的同時也抑制PI3K，但在達到DNAPK的抑制濃度的同時，也抑制了參與多信號途經的激酶CKII。

有報道稱DNAPK特異性抑制劑香蘭素可加強某些DNA損傷劑的細胞毒性，也能抑制X線誘導的染色體畸變，但其在體內的IC50高達毫米濃度水平，同樣不適用于臨床治療[17]。

最近BP Nutley等[18]對DNAPK抑制物NU7026進行臨床前藥動學及代謝情況進行研究，發現每秒10μM是NU7026的最低給藥速度，在人卵巢癌細胞暴露3Gy電離強度后4小時起放射增敏作用，以5mg/kg的量經靜脈注入大鼠體內，因清除率很高以0.1108/H的速度從血漿清除，以20mg/kg的量靜脈與口服的生物利用度分別為20％、15％。他們認為NU7026應每天分4次以總量100mg/kg經靜脈給藥才能達到放療增敏效果。

渥曼青霉素和LY294002等是DNAPK和PI3K的非特異性抑制劑，而PI3K抑制劑可誘導細胞周期的停止，以及導致全身毒性包括生長因子信號參與的許多細胞生理過程[19]，因此開發對DNAPK特異性高，而對其他PI3K影響極小的抑制劑非常重要。

另外，有人發現含芐達明2ones復合物具有特異性激酶抑制作用，從此庫篩選出的藥物SU11752可通過競爭ATP結合位點抑制DNAPK，其IC50為0.13μM[20]，當濃度為12μM時，SU11752尚可抑制雙鏈損傷的修復；濃度為50μM時，可使放療的敏感性增強5倍。也發現當SU11752在IC50為1.1μM時，也可抑制p110γ，這表明放療敏感性的增加可能由于抑制了其他因子而非DNAPK。

6 結論

大多數放療所產生的DNA損傷可被特異性或非特異性途徑識別并修復，幾乎所有的損傷都不是只通過一條途徑修復的，且很多時候細胞僅通過一條途經就可生存下來。因此修復活性的抑制，尤其是作為DNA修復基本組分的DNAPK活性的抑制在放療增敏方面有重要作用。放射腫瘤學的核心是能靶向腫瘤細胞并使正常組織的損傷保持在一個可耐受的水平，對此，DNAPK抑制劑的開發與應用是關鍵，但究竟哪一種腫瘤組織在利用DNAPK抑制劑時特異性強呢？除帶來全身毒性和染色體不穩定性的潛在后果外， DNAPK的活性是否可以明確地作為腫瘤細胞對放療敏感性的一個重要指標呢？這些都是我們需要進一步研究的課題。另外目前的研究已表明對于實體瘤，放療聯合DNAPK抑制劑由于全身毒性小而成為具有應用前景的項目。然而，因為并不能順利展開關于全身毒性的臨床試驗，DNAPK抑制劑應用的濃度只能來自體外細胞試驗的推斷，因此仍有待于開發更多有潛力的抑制劑。

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