作者：張鈺， 李軼杰， 馬正海， 陳璇， 潘曉燕， 張富春

【摘要】 目的: 探討分枝桿菌熱休克蛋白（HSP70）對(duì)草原兔尾鼠卵透明帶3（LZP3）免疫不育效果的增強(qiáng)作用。方法: 將HSP70全長(zhǎng)和C端分別與LZP3融合構(gòu)建pcD-L-HSP70和pcD-L-HSP70C重組質(zhì)粒， 同時(shí)與具有免疫不育功能的pcD-L和pcD-ACLC一起分別免疫NIH小鼠， 分別檢測(cè)重組質(zhì)粒在機(jī)體真核細(xì)胞中的表達(dá)情況、 T細(xì)胞增殖及體液免疫水平、 抗生育效果、 卵巢的病理變化和免疫熒光定位。結(jié)果: LZP3構(gòu)建的重組質(zhì)粒均能在小鼠肝臟中表達(dá); 免疫后能刺激機(jī)體T細(xì)胞增殖， 尤其是pcD-ACLC和 pcD-L-HSP70C免疫組（P<0.01）; 同時(shí)激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體（P<0.05）; 除pcD-L-HSP70免疫組外其他3種重組質(zhì)粒均具有抗生育效果（P<0.05）， 且 pcD-ACLC和pcD-L-HSP70C極明顯地降低了小鼠平均窩仔數(shù)（P<0.01）且未引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生卵巢炎; 直接免疫熒光結(jié)果表明在綠色激發(fā)光下小鼠卵母細(xì)胞的卵透明帶均能發(fā)出綠色熒光。結(jié)論: 與pcD-L-HSP70免疫相比， pcD-L-HSP70C能明顯地降低小鼠平均窩仔數(shù)， 這表明分枝桿菌熱休克蛋白HSP70C端對(duì)增強(qiáng)LZP3免疫不育效果具有明顯的基因佐劑功效。

【關(guān)鍵詞】 草原兔尾鼠卵透明帶3 免疫不育 HSP70 融合佐劑

［Abstract］ AIM: To investigate the immunocontraceptive effect of Lagurus lagurus zona pellucida 3 gene (LZP3) fused by Mycobacterium tuberculosis HSP70 and C-terminal of HSP70. METHODS: Two immunocontractive recombinant plasmids pcD-L-HSP70 and pcD-L-HSP70C were constructed using LZP3. Meanwhile， pcD-L and pcD-ACLC which were effective immunocontraceptive vaccines were studied as control. RESULTS: After the LZP3 genes were expressed in the livers of mice with the introduction of hydrnamic transfection instead of traditional HeLa cell transfection by RT-PCR， NIH mice were immunized with ZP3 DNA vaccines. The results of ELISA showed that all of the recombinants in mice elicited specific anti-ZP3 antibodies which were combined with the ZP3 of oocytes from the immunized mice in immunofluorescence assay. MTS assay showed that the lymphocytes in all groups were proliferated by stimulating the recombinant LZP3 with no disruption of follicular in ovaries， especially those in groups of pcD-ACLC and pcD-L-HSP70C (P<0.01). Antifertility experiments showed that three groups (besides pcD-L-HSP70) enhanced the sterile effects (P<0.05)， especially those in the groups of pcD-ACLC and pcD-L-HSP70C (P<0.01). CONCLUSION: LZP3 fused by the C-terminal of mycobacterium tuberculosis heat shock protein HSP70 had a good immunocontraceptive effect while LZP3 fused by Mycobacterium tuberculosis heat shock protein HSP70 had a poor effect on birth control. So the C-terminal of Mycobacterium tuberculosis heat shock protein HSP70 might be a better candidate to deliver the adjuvant function in LZP3 DNA immunocontraceptive vaccination than the complete HSP70 molecule.

［Keywords］Lagurus lagurus zona pellucida 3 (LZP3); antifertility; HSP70; fusioned adjuvant

哺乳動(dòng)物的卵透明帶（zona pellucida， ZP）一般由ZP1、 ZP2和ZP3（或ZPA、 ZPB、 ZPC） 3種糖蛋白組成， 其中ZP3含有精子初級(jí)受體， 是精卵結(jié)合過(guò)程中精子必須穿過(guò)的障礙。大量研究表明， 阻斷精子與ZP3的結(jié)合就可以阻斷小鼠、 豬等的生殖過(guò)程， 從而實(shí)現(xiàn)控制哺乳動(dòng)物的種群和數(shù)量［1， 2］。因此ZP3是利用免疫不育技術(shù)控制有害哺乳動(dòng)物的理想靶抗原。熱休克蛋白(HSP)是一些進(jìn)化上非常保守的蛋白質(zhì)家族分子， 其中HSP70家族是HSP中最大的一族， 能與相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)差異很大的蛋白質(zhì)和多肽結(jié)合， 直接作用于免疫系統(tǒng)上的HSP70受體， 很大程度提呈目的基因的表達(dá)產(chǎn)物［3］; 另一方面HSP70具有交叉提呈作用［4］， 將其與ZP3融合可能會(huì)避免DNA疫苗引發(fā)的自身免疫性卵巢炎。HSP70C 端具有刺激產(chǎn)生CC趨化因子、 IL-12、 TNF-α、 NO和促使DC細(xì)胞成熟及T細(xì)胞向Th1型極化發(fā)展的作用， 是HSP70中真正行使佐劑功能的區(qū)域［5］。因此本研究中將草原兔尾鼠卵透明帶3（Lagurus lagurus zona pellucida 3， LZP3）基因與 HSP70及HSP70C 端序列分別融合、 構(gòu)建DNA疫苗pcD-L-HSP70 和pcD-L-HSP70C， 同時(shí)與具有免疫不育功效的重組DNA疫苗pcD-L和pcD-ACLC［2］分別免疫小鼠， 比較抗生育效果， 探究HSP70C端對(duì)免疫不育效果的影響， 為研制高效的DNA不育疫苗奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料 重組質(zhì)粒pcDNA3-LZP3（pcD-L）、 pcDNA3-aat-comp-LZP3-C3d3（pcD-ACLC）、 pcDNA3- LZP3-HSP70（pcD-L-HSP70）和pcDNA3-LZP3-HSP70（C）（pcD-L-HSP70C）由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建; 4~6周齡雌性NIH小鼠購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心; 引物及相關(guān)測(cè)序均由北京奧科生物公司提供完成。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建、 鑒定及純化 設(shè)計(jì)帶有連接子（G-S-G-G-S）3的融合引物［6］ LZP3-HSP70(N) p1(n) 5′-aatgaattcatgtgtgccctgcctctgtg-3′; p2(n): 5′-aatggatccagaaccgccagatccagagccaccccagccctccacagcct-3′; p3(n): 5′-aatggatccggtggctctggatctgctcgtgcggtcgggatc-3′; LZP3-HSP70(c) p3(c): 5′aatggatccggtggctctggatctatccaggaaggctcgggc-3′; p4(c): 5′-aatctcgagtcacttggcctcccggcc-3′。PCR分別擴(kuò)增LZP3、 HSP70和HSP70C端。用EcoR I/BamH I酶切純化的LZP3， BamH I/Xho I酶切純化的HSP70和HSP70C， 然后將其與EcoR I/Xho I酶切的pcDNA3進(jìn)行連接， 構(gòu)建成重組質(zhì)粒pcD-L-HSP70和pcD-L-HSP70C， PCR、 酶切和測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒正確性后用PEG8000純化質(zhì)粒， HITACHI UV3010檢測(cè)質(zhì)粒的純度及含量， 然后用生理鹽水調(diào)整質(zhì)粒的終濃度至1 g/L。

1.2.2 重組質(zhì)粒在體內(nèi)真核細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè) 按照水動(dòng)力體內(nèi)轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞學(xué)說(shuō)［7］， 將溶有重組質(zhì)粒的2.5 mL生理鹽水， 快速注入小鼠尾靜脈8 h后提取小鼠肝臟， RT-PCR檢測(cè)目的基因的表達(dá)情況。

1.2.3 DNA疫苗免疫 隨機(jī)將實(shí)驗(yàn)小鼠分為7組， 每組9只， 于小鼠后腿脛骨前肌預(yù)免5 mL/L普魯卡因100 μL， 24 h后在同一部位多點(diǎn)注射質(zhì)粒DNA 100 μL（質(zhì)粒含量1 g/L）， 2周后免疫加強(qiáng)。加強(qiáng)前于小鼠眼眶靜脈叢取血， 收集血清， -20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 采用常規(guī)的MTS檢測(cè)方法， 分別用ConA、 BSA、 GST-LZP3刺激脾臟單細(xì)胞懸液（1×106）， 每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。以刺激指數(shù)（SI=各刺激組的A值/未加刺激物組A值）測(cè)定小鼠淋巴細(xì)胞的增殖能力。

1.2.5 免疫小鼠抗血清的ELISA檢測(cè) 采用間接ELISA法， 以純化GST-LZP3融合蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)抗原蛋白， 以-20℃凍存血清作為一抗， 羊抗鼠IgG作為二抗，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔A450/655值。

1.2.6 小鼠抗生育實(shí)驗(yàn) 將免疫80 d后的NIH雌鼠與具有生育能力的未免疫雄鼠進(jìn)行1∶1合籠， 第2天檢測(cè)陰栓， 檢測(cè)到的分籠喂養(yǎng)， 20~23 d后計(jì)算生仔數(shù)。

1.2.7 小鼠卵巢組織學(xué)檢測(cè) 將鼠卵巢組織取出后用40 g/L多聚甲醛固定， 脫水透明， 石蠟包埋， 修塊切片后做HE染色，與生理鹽水、 pcDNA3、 pcDNA3-HSP70組作為對(duì)照進(jìn)行分析比較。

1.2.8 小鼠卵母細(xì)胞的免疫熒光檢測(cè) 將非發(fā)情期的實(shí)驗(yàn)鼠分別腹腔注射PMSG（10萬(wàn)U/只）， HCG（10萬(wàn)U/只）， 14~15 h后處死小鼠， 收集卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體（COC）。透明質(zhì)酸酶消化后將單個(gè)成熟的卵母細(xì)胞置于載玻片上， 固定， 封閉， 以-20℃凍存的血清作為一抗， FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG作為二抗， 甘油緩沖液封存后在倒置顯微鏡下觀察、 照相。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 將真核表達(dá)載體pcDNA3和另外5種重組質(zhì)粒載體分別進(jìn)行限制性?xún)?nèi)切酶酶切和PCR檢測(cè)。電泳結(jié)果顯示: pcD-L、 pcD-L-HSP70、 pcD-L-HSP70C和pcD-ACLC的酶切和PCR均得到1100 bp左右的LZP3; pcD-HSP70和pcD-L-HSP70的酶切和PCR均得到1900 bp左右的HSP70全長(zhǎng); 而pcD-L-HSP70C的酶切和PCR則得到500 bp左右的HSP70C端; pcD-ACLC經(jīng)3種酶Hind III/Xho I/Xba I作用后還得到1條2700 bp左右的條帶， 這是3分子的C3d。從酶切和PCR結(jié)果初步推測(cè)重組質(zhì)粒構(gòu)建正確， 測(cè)序結(jié)果再次證明重組質(zhì)粒的正確性（圖1）。

圖1 重組質(zhì)粒的酶切和PCR鑒定（略）

Fig 1 Restriction enzyme digestion analysis and PCR of recombinant plasmids

1: Negative control of PCR; 2， 13， 16: DL 15000 marker; 3: pcDNA3 pcDNA3 digested by Hind III/Xho I; 4: PCR of pcDNA3; 5: pcDNA3-LZP3 pcDNA3 digested by Hind III/Xho I; 6: PCR of pcDNA3-LZP3; 7: pcDNA3-HSP70 digested by Hind III/Xho I; 8: PCR of pcDNA3-HSP70; 9: pcDNA3-LZP3-HSP70 digested by Hind III/BamH I/Xho I; 10: PCR of pcDNA3-LZP3-HSP70; 11: pcDNA3-LZP3-HSP70(C) digested by Hind III/BamH I/Xho I; 12: PCR of pcDNA3-LZP3-HSP70(C); 14: PCR of pcDNA3-Aat-Comp-LZP3-C3d3; 15: pcDNA3-Aat-Comp-LZP3-C3d3 digested by Hind III/Xho I/Xba I.

2.2 重組質(zhì)粒在機(jī)體真核細(xì)胞中表達(dá)的RT-PCR檢測(cè) 提取小鼠肝臟總RNA， 然后將其反轉(zhuǎn)錄的cDNA作為模板， 用LZP3核心引物和HSP70引物分別擴(kuò)增目的條帶， 結(jié)果表明幾種重組質(zhì)粒均能在小鼠肝臟中瞬時(shí)表達(dá)， 這說(shuō)明目的基因可以在真核細(xì)胞中進(jìn)行mRNA水平上的表達(dá)（圖2）。

圖2 水動(dòng)力技術(shù)檢測(cè)重組質(zhì)粒在小鼠體內(nèi)的真核表達(dá)（略）

Fig 2 The results of plasmids RT-PCR with the Hydrodynamics-based delivery in mouse liver cells

1: Negative control of PCR; 2， 13: DL 2000 marker; 3: RT-PCR of pcDNA3; 4: PCR of the whole RNA of pcDNA3; 5: RT-PCR of pcDNA3-HSP70; 6: PCR of the whole RNA of pcDNA3-HSP70; 7: RT-PCR of pcDNA3-LZP3; 8: PCR of the whole RNA of pcDNA3-LZP3; 9: RT-PCR of pcDNA3-LZP3-HSP70; 10: PCR of the whole RNA of pcDNA3-LZP3-HSP70; 11: RT-PCR of pcDNA3-LZP3-HSP70c; 12: PCR of the whole RNA of pcDNA3-LZP3-HSP70c; 14: RT-PCR of pcDNA3-Aat-Comp-LZP3-C3d3; 15: PCR of the whole RNA of pcDNA3-Aat-Comp-LZP3-C3d3; 16: DL 15000+2000 marker.

2.3 DNA疫苗免疫小鼠的T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng) 淋巴細(xì)胞增殖刺激指數(shù)結(jié)果表明， 與對(duì)照相比， pcD-L、 pcD-L-HSP70、 pcD-L-HSP70C和pcD-ACLC免疫組均能誘導(dǎo)很強(qiáng)的特異性淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)， 其中pcD-L-HSP70C和pcD-ACLC實(shí)驗(yàn)組的增殖效果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）， 說(shuō)明重組質(zhì)粒在小鼠體內(nèi)可以激發(fā)特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)。

2.4 免疫血清中特異性抗體的ELISA檢測(cè) ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示重組質(zhì)粒免疫組在第1次免疫后血清中都出現(xiàn)了特異性抗體， 隨著免疫次數(shù)的增加， 血清中抗體水平均呈上升趨勢(shì)。與對(duì)照組pcDNA3相比， 除pcD-L-HSP70組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）外， 其他3組都極明顯地提高特異性抗體水平（P<0.01）。

2.5 抗生育結(jié)果 SPSS軟件分析抗生育結(jié)果表明: 和對(duì)照組相比， pcD-L、 pcD-L-HSP70、 pcD-L-HSP70C和pcD-ACLC 4種重組質(zhì)粒均能使雌性小鼠平均窩仔數(shù)下降， pcD-L免疫組的平均窩仔數(shù)明顯減少（P<0.05）， pcD-L-HSP70C和pcD-ACLC免疫組的平均窩仔數(shù)極明顯地減少（P<0.01）， 但2組之間的平均窩仔數(shù)沒(méi)有明顯差異; 而pcD-L-HSP70免疫組的平均窩仔數(shù)減少不明顯， 無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.6 小鼠卵巢組織病理學(xué)切片檢測(cè) 小鼠卵巢組織石蠟切片經(jīng)蘇木素-伊紅（HE）染色后， 與正常小鼠和對(duì)照組小鼠卵巢結(jié)構(gòu)相比: 免疫組小鼠卵巢結(jié)構(gòu)無(wú)明顯病理變化， 均存在各個(gè)發(fā)育階段的卵母細(xì)胞， 黃體也未出現(xiàn)異常膨大及細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的炎癥反應(yīng)現(xiàn)象（圖3）。2.7 小鼠成熟卵母細(xì)胞的免疫熒光檢測(cè) 將超排小鼠的成熟卵母細(xì)胞固定到載玻片上進(jìn)行直接和間接免疫熒光檢驗(yàn)， 結(jié)果發(fā)現(xiàn): 無(wú)論是間接免疫熒光還是直接免疫熒光， 在綠色激發(fā)光下， 小鼠的卵透明帶上均能被激發(fā)出綠色熒光（圖4）。

3 討論 在DNA疫苗的發(fā)展進(jìn)程中， 選擇合適的佐劑與選擇目的基因本身同樣重要， 本研究中我們將HSP70與抗生育基因LZP3融合探討其對(duì)免疫不育效果的影響。HSP70是一種很好的廣譜免疫佐劑， 然而一些研究表明HSP70存在一定的局限性， 相比之下HSP70C端具有更好的免疫佐劑功能。葛菲菲等［8］發(fā)現(xiàn)融合HSP70全長(zhǎng)雖使IL-2的水平及T細(xì)胞增殖有所提高和增強(qiáng)， 但效果遠(yuǎn)不及融合HSP70C端免疫組明顯， 推測(cè)可能是由于抗原提呈細(xì)胞(APC)表面受體與HSP70結(jié)合區(qū)域集中在肽連接區(qū)， 而ATP酶區(qū)有抑制IL-10和TGF-α產(chǎn)生的作用， 且HSP70會(huì)掩蓋某些抗原表位， 從而降低了HSP70全長(zhǎng)載體分子效應(yīng)， 而HSP70肽連接區(qū)則體現(xiàn)了明顯的佐劑優(yōu)勢(shì)［9］。隨后， Li等［10］同樣發(fā)現(xiàn)融合HSP70C端(359~610)的DNA疫苗不僅能明顯地提高HBsAg的特異性CTL水平， 而且能夠克服Ld限制性抗原決定簇所造成的抑制作用， 同時(shí)還可高效清除機(jī)體循環(huán)系統(tǒng)中的HBsAg， 大大下調(diào)HBV的復(fù)制， 而融合HSP70N端及全長(zhǎng)的DNA疫苗卻無(wú)此功用， 認(rèn)為這也與HSP70359~610具有Th1樣細(xì)胞因子和CC趨化因子功能有關(guān)。Cardozo等［11］進(jìn)一步表明HSP70C端能和蛋白酶體作用形成一個(gè)指環(huán)樣的“U”型結(jié)構(gòu)， 這種由十肽重復(fù)序列組成的結(jié)構(gòu)廣泛存在于泛素連接酶中， 它可使HSP70C 端融合的目的基因被精確降解， 進(jìn)而被胞吞和高效提呈。基于上述原因， 本研究采用15個(gè)小分子氨基酸即（G-S-G-G-S）3作為連接子將不育基因（LZP3）和HSP70C端進(jìn)行融合表達(dá)， 為HSP70C和LZP3目的蛋白的正確折疊提供更為廣闊充分的三維空間結(jié)構(gòu)來(lái)增強(qiáng)免疫效果［9］。結(jié)果表明pcD-L-HSP70C免疫組與pcD-L-HSP70相比極明顯地激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性的LZP3抗體水平和T細(xì)胞增殖能力， 表明HSP70C端功能相對(duì)不明區(qū)對(duì)增強(qiáng)LZP3的免疫不育具有佐劑增強(qiáng)的生物學(xué)功能， 且極明顯地降低小鼠平均窩仔數(shù)， 實(shí)現(xiàn)了預(yù)期避免機(jī)體卵巢炎發(fā)生的目的， 為篩選高效安全的DNA不育疫苗控制草原兔尾鼠免疫不育的研究和應(yīng)用提供了可靠的理論基礎(chǔ)。

圖3 免疫小鼠卵巢組織病理切片檢測(cè) （略）

Fig 3 Histology of 4 μm ovarian sections from DNA vaccines immunized mice

A: Non-immunized mice; B: Mice intramuscularly immunized with 90 mL/L saline; C: Mice intramuscularly immunized with pcDNA3.0; D: Mice intramuscularly immunized with pcDNA3-HSP70; E: Mice orally immunized with pcDNA3-LZP3; F: Mice orally immunized with pcDNA3-LZP3-HSP70; G: Mice orally immunized with pcDNA3-LZP3-HSP70c; H: Mice orally immunized with pcDNA3-Aat-Comp-LZP3-C3d3.

圖4 小鼠卵母細(xì)胞的直接和間接免疫熒光檢測(cè)（略）

Fig 4 Immunofluorescence detection of direction and indirection of oocytes

A: Detection of oocytes from control mice in transfer light（×100）; B: Direction immunofluorescence detection of oocytes from control mice（×100）; C: Detection of oocytes from mice immunised by pcDNA3-LZP3-HSP70 in transfer light（×200）; D: Direction immunofluorescence detection of oocytes from mice immunised by pcDNA3-LZP3-HSP70（×200）; E: Detection of oocytes from control mice in transfer light（×100）; F: Indirection immunofluorescence detection of oocytes from control mice（×100）; G: Detection of oocytes from pcDNA3-LZP3-HSP70(c) mice in transfer light（×100）; H: Direction immunofluorescence detection of oocytes from pcDNA3-LZP3-HSP70c mice（×100）.