作者：王海英 章春筍 李彧媛

【摘要】 建立了一種基于毛細管的振蕩流反轉錄聚合酶鏈式反應(RTPCR)的微流控裝置檢測煙草花葉病毒(TMV)的新方法。根據TMV移動蛋白基因設計一對PCR引物，對粗提純TMV顆粒直接進行RTPCR。用0.025%小牛血清蛋白(BSA)對反應毛細管內壁進行靜力學和動力學鈍化，提高了PCR效率。在此微流控裝置上進行RTPCR，流速為70 μL/min時， 檢出限為0.01 μg cDNA;可以在17 min內成功擴增出179 bp的目的DNA片段。

【關鍵詞】 微流控， 振蕩流， 反轉錄聚合酶鏈式反應， 煙草花葉病毒

1 引 言

在發病早期對植株的植物病毒進行快速準確的檢測非常重要[1]。反轉錄聚合酶鏈式反應(RTPCR)技術因其具有較高的靈敏度和特異性，已成為一種廣泛采用的生物檢測方法。RTPCR技術易與其它高靈敏度的檢測方法相結合，如電化學發光[2～9]、激光誘導熒光[10～13]和毛細管電泳[14]等檢測技術，使其檢測靈敏度進一步提高。

傳統PCR通常具有較大的熱容，熱循環時間長，能量消耗高，且占有較大體積。為了克服這些缺點，一些研究者們開展了PCR微流控技術的研究[15]。目前，微流控PCR有兩種形式：靜態池式PCR和動態連續流動式PCR。前者是傳統PCR微型化，主要對系統熱容進行優化，以減少加熱和冷卻時間。連續流動式PCR則是PCR溶液在微通道中連續流動，從而通過2個或3個恒溫區以實現溫度的循環。在該裝置中， PCR溶液變溫速度較快，而且可實現超高通量的反應，因此受到人們的關注。

連續流動式PCR可分為3種形式：蜿蜒通道單向流式PCR[16]、螺旋通道單向流式PCR[17，18]和直通道振蕩流式PCR[19，20]。前兩者反應循環數和時間通常是固定的，很難根據實驗要求進行調整;也不宜進行高通量平行反應。為了解決上述問題，研究者們提出直通道振蕩流PCR，反應溶液在所需溫度區往復振蕩來實現PCR。本研究是在前期研究[18]的基礎上，改進了連續流動式PCR的實現形式，在基于毛細管通道的振蕩流RTPCR微流控裝置上對煙草花葉病毒(TMV)進行快速檢測。通過優化實驗條件，對粗提純的TMV顆粒直接進行反轉錄得到模板cDNA，然后進行PCR。既省去了提取RNA的繁瑣步驟，又節省試劑成本和實驗時間，具有一定的應用前景。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

振蕩流RTPCR裝置如圖1A所示。由溫度控制與采集系統(實驗室自行設計)、3個銅加熱塊(由廣東省科學院自動化工程研制中心加工)、3根加熱棒(直徑8 mm， 長40 mm， 100 W， 廣州豪怡電熱電器廠)、K型熱電偶 (直徑0.12 mm， Omega)和一臺CZ7490115精密注射泵(美國Cole Parmer公司)等構成。溫度控制與采集系統通過加熱棒和熱電偶控制3個銅塊上PCR所需溫度。PTFE毛細管(無錫市祥健四氟制品有限公司)包埋在銅塊凹槽中，利用注射泵驅動其中PCR溶液振蕩通過3個恒溫區，完成PCR反應。傳統PCR儀(德國Eppendorf公司)。

RTPCR試劑中Taq聚合酶、dNTP及MMLV反轉錄酶均購于寶生物(大連)有限公司。PCR上/下游引物分別為：5′ATGGAAAGAGCCGACGAG3′和5′ GAAAGCGGACAGA AACCC3′(上海生工生物技術有限公司)。小牛血清蛋白(BSA， 美國Sigma公司);聚乙二醇6000(PEG 6000，廣東光華化學廠有限公司)。

2.2 分析方法

2.2.1 病毒顆粒的反轉錄 PCR管中依次加入1 μL病毒顆粒提取液作為模板、1 μL引物(20 μmol)、ddH2O定容至7 μL，混勻離心3～5 s。70 ℃水浴5 min后，冰浴2 min，離心后依次加入1 μL 10×Buffer， 0.5 μL RNase Inhibitor (40 U/μL)， 0.5 μL dNTP Mix(10 mmol/L)， 1 μL MMLV反轉錄酶(200 U/μL)，終體積為10 μL。42 ℃保溫60 min后，于70 ℃ 加熱15 min結束反應，置冰上保存，以備PCR實驗。

2.2.2 毛細管內表面的處理 實驗依次采用200 μL 0.5% NaClO，200 μL ddH2O， 200 μL 1×PCR緩沖液沖洗毛細管。用0.025% BSA對毛細管內表面進行靜力學和動力學鈍化[18]，以便使PCR順利進行。

2.2.3 振蕩流RTPCR擴增 長約20 cm PTFE毛細管包埋在3個銅加熱塊的凹槽中，每個銅加熱塊邊長為4 cm×4 cm。溫度依次設定為94，72和56 ℃(在傳統PCR儀上優化)。PCR溶液在毛細管中往復振蕩1次，完成1個PCR循環。PCR反應時間以傳統PCR儀的擴增時間為對照進行優化。5 μL PCR溶液從進口處引入毛細管通道后，在注射泵驅動下，以空氣為載流體來推動溶液流動，實現振蕩流PCR。PCR溶液兩端各用石蠟油進行密封，以防止蒸發。在振蕩流RTPCR中，5 μL PCR溶液中含有1×PCR緩沖液、0.2 mmol/L dNTP、0.5 μmol/L上/下游引物、4 μg/L模板cDNA、0.025 U/μL Taq 聚合酶、一定濃度的BSA以及相應體積的ddH2O。 分 析 化 學第37卷第9期王海英等：微流控振蕩流反轉錄聚合酶鏈式反應快速檢測煙草花葉病毒

3 結果與討論

3.1 對粗提純的病毒顆粒直接進行RTPCR

病毒顆粒在70 ℃時就可熱裂解釋放出RNA，一次加熱可完成RNA分子的提取和變性，然后加入其它反轉錄試劑，完成RTPCR反應。圖2中A和B分別是對病毒顆粒和提純的RNA進行的RTPCR擴增，條帶2初始RNA濃度均為0.2 g/L，2～9依次以10×梯度進行稀釋，病毒顆粒稀釋107倍后，仍可擴增出產物，這說明直接用粗提純的病毒顆粒進行RTPCR反應可以達到檢測的目的。

直接用病毒顆粒進行RTPCR反應不僅省略了提取RNA的繁瑣步驟，避免RNA提取試劑對操作者的危害，而且操作過程簡單易行。另外，RNA容易降解，不易保存，而提取的病毒顆?？梢灾苯釉诹姿猁}緩沖液中方便保存。

3.2 模板濃度對RTPCR擴增反應的影響

較大比表面積的毛細管會對PCR體系中各種成分產生吸附作用，對反應有不良影響。PCR體系中的Taq酶、引物、dNTPs及Mg2+一般都是過量的，對反應影響相對較小。然而模板cDNA濃度的變化對擴增有較大影響。圖3是在流速為70 μL/min的情況下對不同濃度cDNA模板進行擴增的結果。由圖3可知，cDNA濃度為1和0.1 g/L時可以很好地擴增出目的條帶;當cDNA濃度為0.01 g/L時擴增條帶仍然可以通過瓊脂糖電泳檢測出;隨著濃度進一步降低，已經無法檢測出條帶，只有少量的引物二聚體出現。 圖3 cDNA模板濃度對振蕩流RTPCR擴增的影響

3.3 樣品流動的變速和恒速對振蕩流RTPCR擴增反應的影響

PCR擴增過程中樣品一旦到達變性溫度應迅速冷卻到退火溫度，完成引物與模板的配對，這一步對PCR效率影響很大。本實驗通過改變振蕩流兩個方向的流速，增大由變性區到退火區的流速，減少其流動時間，明顯提高了PCR效率。如圖4所示，在同一流速(70 μL/min)下， 由94 ℃變性到56 ℃退火所用時間為52 s，而把由94 ℃變性到56℃退火的流速提高了4倍后，反應時間縮短到13 s，而擴增效率卻有了很大的提高。

3.4 傳統PCR儀與振蕩流RTPCR微流控裝置進行擴增反應的比較中條帶1是在傳統PCR儀上經過35個循環(94 ℃，30 s; 54 ℃，30 s; 72 ℃，30 s)，擴增時間1 h的擴增結果;條帶2為陰性對照;條帶3是振蕩流RTPCR的擴增結果，經過35個PCR循環，擴增時間30 min。由圖5可以看出振蕩流微流控裝置可以對目的DNA片段進行成功的擴增，并且擴增時間明顯縮短。

3.5 煙草花葉病毒雙溫振蕩流RTPCR的快速檢測

當DNA擴增片斷小于300 bp時，退火溫度與延伸溫度可以合并，即雙溫PCR。本實驗以反轉錄出的cDNA為模板，進行雙溫PCR擴增。通過優化流速和縮短反應時間，可以在短時間內檢測出反應產物。如圖6所示，隨著流速的加快，擴增產物數量逐漸減少，35個循環擴增時間減小至17 min時仍可以擴增出產物。通常情況下由于底物的消耗和酶活力降低，PCR反應在25～30次循環就達到平臺期，PCR產物不再上升。在模板濃度較高的情況下，20次循環就可檢測出產物，反應時間可以減少3/7。