【摘要】目的 觀察IκBα突變型基因?qū)τ郎窠?jīng)前體細(xì)胞株（INPCs）增殖、分化及部分炎性細(xì)胞因子分泌的影響。方法 在已經(jīng)建立的轉(zhuǎn)染pcDNA3.1及轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/IκBαM的INPCs的基礎(chǔ)上，用MTT法繪制兩細(xì)胞株的生長曲線，用流式細(xì)胞儀檢測其增殖指數(shù)，以5％小牛血清誘導(dǎo)分化后，采用western blot檢測兩株細(xì)胞的分化情況，同時用realtime RT-PCR比較TNF-α、IL-1β和IL-6在兩種細(xì)胞株中的表達(dá)。 結(jié)果 生長曲線及流式細(xì)胞儀測得的細(xì)胞增殖指數(shù)提示：轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/IκBαM INPCs的增殖速度較轉(zhuǎn)染pcDNA3.1的INPCs明顯降低。經(jīng)血清誘導(dǎo)分化后，兩者均大量表達(dá)膠原纖維酸性蛋白；轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IκBαM的INPCs較轉(zhuǎn)pcDNA3.1的INPCs IL-1β和IL-6的表達(dá)減低，但TNF-α表達(dá)變化無顯著性。結(jié)論 IκBα突變型基因可減慢INPCs的增殖，并減少部分炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，但對INPCs的分化無顯著影響。

【關(guān)鍵詞】干細(xì)胞； NF-κB抑制因子α；細(xì)胞增殖；細(xì)胞分化；細(xì)胞因子

Effect of mutated IκBα gene on the biological characteristics of immortalized neural progenitor cell strain

ZHU Chang， LIU Zhi-heng， ZHANG Chuan-han， et al. Department of Anesthesiology，Tongji Hospital of Tongji Medical College， Huazhong University of Science & Technology， Wuhan 430030， China

【Abstract】 Objective To observe the effect of mutated IκBα gene on the proliferation，differentiation and cytokine secretion of immortalized neural progenitor cell strain(INPCs). Methods After the establishment of mutated IκBα gene transfected INPCs and blank plasmid transfected INPCs， MTT staining and flow cytometry were used to draw the growth curve and measure the cell proliferation index. Western blot was carried out to observe the differentiation of the two cell strains after 5% blood serum induced differentiation. The expression of TNF-α、IL-1β and IL-6 was measured by realtime RT-PCR. Results It was established by growth curve and cell proliferation index that the proliferation was slowed down in mutated IκBα gene transfected INPCs compared with blank plasmid transfected INPCs. After blood serum induced differentiation，glial fibrillary acidic protein was highly expressed in the two cell strains. There was no difference in the expression of TNF-α between mutated IκBα gene transfected INPCs and blank plasmid transfected INPCs. The expression of IL-1β and IL-6 was reduced in mutated IκBα gene transfected INPCs. Conclusion Mutated IκBα gene can slow down the proliferation of INPCs， reduce the expression of some cytokines， but didn’t influence the differentiation of INPCs.

【Key words】Stem cells；NF-kappaB inhibitor alpha；Cell proliferation ；Cell differentiation； Cytokines

本實(shí)驗(yàn)室成功構(gòu)建了SV40Tag永生化的大鼠神經(jīng)前體細(xì)胞株（INPCs）[1]，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了轉(zhuǎn)IκBα突變型基因永生化神經(jīng)前體細(xì)胞株。作為細(xì)胞移植治療的細(xì)胞來源和外源基因的載體，INPCs的生物學(xué)特性在轉(zhuǎn)入外源基因后有何改變，是進(jìn)一步研究首先應(yīng)關(guān)注的問題。本研究擬通過比較轉(zhuǎn)IκBα突變型基因及空白對照載體的INPCs在增殖、分化以及細(xì)胞因子分泌功能上的差異，為進(jìn)一步將該轉(zhuǎn)基因細(xì)胞用于細(xì)胞移植治療腦缺血等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

材料 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1及pcDNA3.1/IκBαM的INPCs由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，DMEM/F12培養(yǎng)基、B27無血清培養(yǎng)添加劑（Gibco公司，美國）；堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)（Pepro Tech公司，英國）； MTT、碘化丙啶（PI）（Sigma公司，美國）；抗β-actin抗體、抗膠原纖維酸性蛋白（GFAP）抗體、抗微管相關(guān)蛋白2（MAP2）抗體（Neomarkers公司，美國）； Trizol試劑（上海華舜公司），SYBR ExScriptTM RT-PCR Kit (Takara，日本)。

細(xì)胞培養(yǎng)及傳代 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1或pcDNA3.1/IκBαM的INPCs在含2%B27、20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF、0.3μg/ml嘌呤霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，0.25％胰酶消化傳代。

細(xì)胞生長曲線的繪制 將轉(zhuǎn)染pcDNA3.1及pcDNA3.1/IκBαM的INPCs以每孔5×103的密度接種于96孔板，共種8板，每板每株細(xì)胞接種12孔，每24h取出一板，每孔加入0.2％MTT 50μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，吸去上清液，每孔加入DMSO 150μl，震蕩10 min，在酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司，美國）上測定570nm吸光度值，并繪制生長曲線。

細(xì)胞增殖指數(shù)的測定 將轉(zhuǎn)染pcDNA3.1及pcDNA3.1/IκBαM的INPCs分別制成單細(xì)胞懸液，PBS 洗一次后，加入-20 ℃預(yù)冷的80 %乙醇固定， 冰浴30min，固定后的細(xì)胞用PBS 洗滌2 次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1 ×106 / ml，加入PI (終濃度為50μg/mL)和RNA酶（終濃度為1μg/ml）， 室溫避光孵育1h后上機(jī)檢測，細(xì)胞增殖指數(shù)= ( S + G2 /M) / ( G0 /G1 + S +G2 /M) ×100%。

Western blot檢測細(xì)胞分化 分別提取轉(zhuǎn)pcDNA3.1 INPCs及轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IκBαM INPCs的細(xì)胞總蛋白，兩株細(xì)胞以5％血清誘導(dǎo)分化一周后分別提取總蛋白，以β-actin為內(nèi)參照，取等量的蛋白質(zhì)經(jīng)10%聚丙稀酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上， 用5%脫脂奶粉封閉1h，加10μg/ml抗GFAP單抗、抗MAP2單抗或抗β-actin單抗，室溫孵育1h，漂洗后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h，漂洗后二氨基聯(lián)苯胺顯色2～3 min，水洗后照相。

Realtime RT-PCR 檢測細(xì)胞因子的表達(dá) 用Trizol試劑提取轉(zhuǎn)pcDNA3.1 INPCs及轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IκBαM INPCs的總mRNA，8453E型紫外分光光度儀（Agilent公司，美國）測定RNA濃度，參照SYBR ExScriptTM RT-PCR試劑盒說明操作，用等量的總mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板在LightCycler real-time PCR儀（羅氏公司，美國）上進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性10 s，94℃變性5 s，60℃退火及延伸20s，共反應(yīng)40個循環(huán)后，分析融解曲線，參照Livak等人的方法，以2－σσCT法分析細(xì)胞因子的的相對表達(dá)量[2]，引物列表見表1。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 12. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ ±s）表示，不同細(xì)胞株間比較采用成組t檢驗(yàn)，P < 0. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

生長曲線的繪制 采用MTT法繪制的轉(zhuǎn)pcDNA3.1INPCs及轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IκBαM INPCs的生長曲線，見圖1。除接種后第一天外，各時點(diǎn)轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IκBαM INPCs加入MTT后，其570nm吸光度值均較相同時點(diǎn)轉(zhuǎn)pcDNA3.1 INPCs低，同時點(diǎn)兩株細(xì)胞間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞增殖指數(shù) 轉(zhuǎn)pcDNA3.1INPCs 及轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IκBαM INPCs的細(xì)胞增殖指數(shù)依次為61.64％±4.25％和46.19％±0.86％，兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Western blot檢測細(xì)胞分化 血清誘導(dǎo)分化后，兩株細(xì)胞MAP2的蛋白條帶極其微弱，GFAP條帶明顯，誘導(dǎo)分化前，轉(zhuǎn)pcDNA3.1INPCs 及轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IκBαM INPCs均有明顯的MAP2條帶，而無明顯的GFAP條帶，兩株細(xì)胞間比較，MAP2和GFAP條帶的明暗程度在分化前及分化后無明顯差異。（見圖2）

細(xì)胞因子的表達(dá) 用Realtime RT-PCR的方法檢測轉(zhuǎn)pcDNA3.1 INPCs及轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IκBαM INPCs細(xì)胞因子mRNA的相對表達(dá)量，如表2所示。將轉(zhuǎn)pcDNA3.1INPCs相應(yīng)細(xì)胞因子的表達(dá)量定義為1，兩株細(xì)胞TNF-α的mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IκBαM INPCs中IL-6 及IL-1β mRNA的表達(dá)較轉(zhuǎn)pcDNA3.1的INPCs低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

討 論

神經(jīng)前體細(xì)胞具有不斷分裂增殖、自我更新以及多分化潛能[3]。轉(zhuǎn)pcDNA3.1INPCs 及轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IκBαM INPCs的培養(yǎng)和傳代證實(shí)，轉(zhuǎn)入IκBα突變型基因后，INPCs仍能不斷分裂增殖，保持了自我更新的特性。而western blot通過半定量的方式證實(shí)，轉(zhuǎn)入的外源基因并未影響INPCs的分化特性，即血清誘導(dǎo)分化后大部分細(xì)胞表達(dá)作為星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志的GFAP，分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞，僅有少量細(xì)胞表達(dá)作為神經(jīng)元標(biāo)志的MAP2，分化為神經(jīng)元。增殖和分化潛能的保持即證實(shí)了轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IκBαM INPCs保持了神經(jīng)前體細(xì)胞的特性，同時也是該細(xì)胞株用于細(xì)胞移植治療的基本保證。

NF-κB是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的核轉(zhuǎn)錄因子，在免疫反應(yīng)、炎癥、細(xì)胞生長、分化、凋亡和癌癥的發(fā)生等方面發(fā)揮多種重要的生理學(xué)功能。國內(nèi)王劍虹等人的研究證實(shí)，IκBα突變型基因轉(zhuǎn)入肝癌細(xì)胞后，可以抑制NF-κB的活性，同時抑制癌細(xì)胞的增殖[4]。Widera等人的研究也證實(shí)，TNF可通過激活NF-κB促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，其原理可能與NF-κB激活后，細(xì)胞周期蛋白D1上調(diào)有關(guān)[5]。本實(shí)驗(yàn)也觀察到，轉(zhuǎn)入IκBα突變型基因后，INPCs生長減慢，細(xì)胞增殖指數(shù)降低，推測該現(xiàn)象是由于IκBα突變型基因下調(diào)NF-κB的活性，使NF-κB下游的一些促細(xì)胞增殖的基因也相應(yīng)下調(diào)，減弱了細(xì)胞增殖。

一些研究證實(shí)，微環(huán)境是影響干細(xì)胞移植治療效果的重要因素[6] ，細(xì)胞因子是微環(huán)境的重要成分。INPCs作為細(xì)胞移植治療的種子細(xì)胞，即受到移植處微環(huán)境的影響，同時也通過分泌TNF-α、IL-6 、IL-1β等細(xì)胞