作者：楊永霞，楊生義，梁敏鋒，丘翠環(huán)， 張薇，許靜芬

【摘要】 目的 應(yīng)用核磁共振氫譜(1H nuclear magnetic resonance，1H NMR)和主成分分析(principal component analysis，PCA)方法研究乙肝后肝硬化患者血清的代謝組變化。方法 慢性乙肝患者血清20例和乙肝后肝硬化患者血清18例，采用BRUKER Avance 500 MHz 超導(dǎo)核磁共振波譜儀進(jìn)行檢測(cè)，并運(yùn)用模式識(shí)別方法分析乙肝后肝硬化患者血清代謝組變化。結(jié)果 乙肝患者和乙肝后肝硬化患者血清的代謝組具有明顯的差異。肝硬化引起血清中的脂和膽堿/磷酸膽堿降低，而乳酸、丙氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、肌酸以及葡萄糖的含量升高。結(jié)論 通過(guò)上述代謝物的變化可以區(qū)分乙肝和乙肝后肝硬化患者。這種基于磁共振氫譜和主成分分析的代謝組學(xué)方法可以為肝硬化的診斷提供可靠的分子水平上的代謝依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 磁共振氫譜;肝硬化;代謝;主成分分析

Abstract:Objective 1H Nuclear magnetic resonance (1H NMR) spectroscopy in conjunction with principal component analysis (PCA) had been employed to characterize the metabolite composition of the serum samples from the patients with posthepatitic cirrhosis.Methods 1H NMR spectra were measured for serum samples from 20 patients with chronic hepatitis B and 18 patients with posthepatitic cirrhosis，and the spectra data were analyzed by PCA to reveal the metabonomic changes.Results There were clear metabonomic differences between the patients with chronic hepatitis B and the patients with posthepatitic cirrhosis that could lead to decreased levels in lipids and phosphocholine/choline，and escalating levels of lactate，alanine，methionine，glutamine，creatine and glucose. Conclusion The results showed that the metabolite changes of serum from the patients with posthepatitic cirrhosis were markedly different from those of the patients with chronic hepatitis B，what indicated that 1H NMRand principal component analysisbased metabonomic technique could provide an efficient tool for the diagnosis of posthepatitic cirrhosis at molecular level.

Key words:proton nuclear magnetic resonance; posthepatitic cirrhosis; metabonomics; principal component analysis

核磁共振1H譜(1H nuclear magnetic resonance， 1H NMR)是研究生物樣品(如生物組織/尿液/血液/組織提取液等)代謝組變化的一種很重要的手段，而且這種方法具有良好的客觀性和可重復(fù)性，無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行特殊處理，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)整個(gè)代謝組的同步檢測(cè)。肝硬化是影響人類健康的主要疾病之一，慢性乙肝若不能有效控制，可發(fā)展為肝硬化，如果能在肝硬化出現(xiàn)早期準(zhǔn)確診斷，則會(huì)在很大程度上改善肝病的預(yù)后[1]。本研究采用磁共振1H譜來(lái)研究乙肝后肝硬化患者血清的代謝組特征，結(jié)合模式識(shí)別分析方法，找出肝硬化出現(xiàn)后代謝組的改變，評(píng)價(jià)磁共振氫譜用于乙肝后肝硬化診斷的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 樣品收集 收集南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院感染內(nèi)科患者血清樣本38例(根據(jù)臨床乙肝和乙肝后肝硬化診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]，慢性乙肝20例，乙肝后肝硬化18例)，置-80 ℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 樣品預(yù)處理 1H NMR譜采樣前，將所有血清樣本解凍，在4 ℃下，10 000 g離心 10 min。取300 μL上層血清加至5 mm NMR測(cè)試管中，后加入0.2 mol/L 磷酸緩沖溶液(0.2 mol/L Na2HPO40.2 mol/L NaH2PO4，pH=7.4)200 μL 和重水50 μL，振蕩混勻。

1.3 NMR實(shí)驗(yàn) NMR實(shí)驗(yàn)采用BRUKER Avance 500 MHz 超導(dǎo)核磁共振波譜儀，實(shí)驗(yàn)溫度為298 K。采用CarrPurcellMeiboomGill (CPMG，relaxation delay90(τ180τ)nacquisition)脈沖序列，回波時(shí)間2 nτ=100 ms， 4 s延遲時(shí)間，10 kHz譜寬，64 k數(shù)據(jù)點(diǎn)，采集次數(shù)為128。傅立葉變化前加0.3 Hz 指數(shù)窗函數(shù)處理。采用TOPSPIN 2.0軟件進(jìn)行手動(dòng)調(diào)相和基線校正。化學(xué)位移以乳酸甲基雙重峰δ 1.33進(jìn)行定標(biāo)。

1.4 1H NMR譜的數(shù)據(jù)預(yù)處理和主成分分析 采用軟件TOPSPIN 2.0對(duì)所有1H CPMG譜進(jìn)行自動(dòng)積分，積分區(qū)間δ0.5～9.0，積分間隔0.02 ppm。為了消除剩余水峰引起的影響，將積分區(qū)間δ 4.7～5.2的積分值設(shè)為零。此外，為了消除樣本間因濃度不同而帶來(lái)的分析誤差，在進(jìn)行主成分分析之前對(duì)各分段積分值進(jìn)行歸一化處理。歸一化后的數(shù)值將作為原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入軟件SIMCAP 10.0 (Umetrics，Sweden)中進(jìn)行模式識(shí)別主成分分析(principal component analysis，PCA)。

2 結(jié)果

2.1 乙肝后肝硬化患者血清的磁共振1H譜

圖1是代表性的乙肝后肝硬化患者血清1H CPMG譜，譜峰信號(hào)的歸屬

2.2 PCA分析

圖2給出對(duì)乙肝患者(●)和乙肝后肝硬化患者(▲)血清1H CPMG譜的主成分分析結(jié)果(PC1 vs PC2，R2=72.2%)，分析結(jié)果以得分圖和負(fù)載圖給出。在得分圖中乙肝患者與乙肝后肝硬化患者血清樣本區(qū)分很明顯，兩類不同樣本間的代謝差異可以從負(fù)載圖中得到。乙肝后肝硬化患者血清中脂和膽堿/磷酸膽堿的含量是降低的，而乳酸、丙氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、肌酸和葡萄糖的含量則是升高的。

3 討論

磁共振氫譜是一種無(wú)創(chuàng)性的檢測(cè)體內(nèi)生化代謝改變的新方法[5]，目前已經(jīng)應(yīng)用到多種疾病的分析中，以便更好地研究由于病變所引起的生物體的代謝變化，從而為疾病的診斷提供一種可靠的分子水平上的代謝依據(jù)。由于一張1H NMR譜中有很多代謝物信號(hào)峰，且代謝物之間存在一定的聯(lián)系，所以僅僅憑借肉眼很難全部觀察到這些代謝物的變化，而基于多變量的主成分(PCA)分析方法，是通過(guò)對(duì)原始譜圖進(jìn)行降維，然后對(duì)所有樣本進(jìn)行分析，能夠給出不同類型樣本間的代謝差異。通過(guò)對(duì)乙肝和乙肝后肝硬化病人血清磁共振氫譜的PCA分析表明，這兩組血清的代謝組特征明顯不同，與乙肝患者血清代謝組相比，乙肝后肝硬化引起患者血清中脂和膽堿/磷酸膽堿的含量降低，而乳酸、丙氨酸、谷氨酰胺、肌酸和葡萄糖的含量升高。

血清中脂類物質(zhì)含量的改變?cè)诤芏嗉膊≈卸加邪l(fā)現(xiàn)[6，7]，它表明肝硬化形成過(guò)程中脂代謝發(fā)生改變。膽堿是細(xì)胞膜的重要組成成分，肝硬化的產(chǎn)生導(dǎo)致血清中膽堿含量降低，這可能與肝細(xì)胞結(jié)節(jié)形成有關(guān)，與前人的研究結(jié)果類似[8]。葡萄糖的含量在乙肝后肝硬化患者血清中是升高的，這表明肝硬化形成引起血中糖代謝紊亂，糖代謝能力降低。在無(wú)氧條件下，葡萄糖會(huì)經(jīng)過(guò)糖酵解過(guò)程轉(zhuǎn)變成乳酸，如果人體能量代謝正常，乳酸將會(huì)被血液帶至肝臟，進(jìn)一步分解為水和二氧化碳并產(chǎn)生熱量，血液中乳酸不會(huì)堆積。而肝硬化、肝細(xì)胞彌散變性會(huì)引起肝細(xì)胞內(nèi)乳酸鹽的專運(yùn)能力降低，肝臟功能受損，造成乳酸鹽堆積[9]，所以肝硬化患者血清中乳酸升高。此外，與乙肝患者血清相比，乙肝后肝硬化患者血清中的谷氨酰胺升高，提示存在體內(nèi)氨代謝的紊亂。谷氨酰胺是氨的儲(chǔ)存和運(yùn)輸形式，參與神經(jīng)遞質(zhì)活動(dòng)，肝細(xì)胞長(zhǎng)期損傷導(dǎo)致其尿素合成障礙，血氨升高，產(chǎn)生更多的谷氨酰胺[1]。所以，肝硬化引起患者血中脂代謝、能量代謝和氨代謝過(guò)程的改變。

總之，基于磁共振氫譜和模式識(shí)別的代謝組學(xué)方法能夠給出乙肝后肝硬化患者血清的代謝特征以及相關(guān)的代謝改變，這可以從分子水平去區(qū)分乙肝和乙肝后肝硬化，為乙肝后肝硬化的臨床診斷提供可靠的分子水平上的代謝依據(jù)。