作者：楊永霞，楊生義，梁敏鋒，丘翠環， 張薇，許靜芬

【摘要】 目的 應用核磁共振氫譜(1H nuclear magnetic resonance，1H NMR)和主成分分析(principal component analysis，PCA)方法研究乙肝后肝硬化患者血清的代謝組變化。方法 慢性乙肝患者血清20例和乙肝后肝硬化患者血清18例，采用BRUKER Avance 500 MHz 超導核磁共振波譜儀進行檢測，并運用模式識別方法分析乙肝后肝硬化患者血清代謝組變化。結果 乙肝患者和乙肝后肝硬化患者血清的代謝組具有明顯的差異。肝硬化引起血清中的脂和膽堿/磷酸膽堿降低，而乳酸、丙氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、肌酸以及葡萄糖的含量升高。結論 通過上述代謝物的變化可以區分乙肝和乙肝后肝硬化患者。這種基于磁共振氫譜和主成分分析的代謝組學方法可以為肝硬化的診斷提供可靠的分子水平上的代謝依據。

【關鍵詞】 磁共振氫譜;肝硬化;代謝;主成分分析

Abstract:Objective 1H Nuclear magnetic resonance (1H NMR) spectroscopy in conjunction with principal component analysis (PCA) had been employed to characterize the metabolite composition of the serum samples from the patients with posthepatitic cirrhosis.Methods 1H NMR spectra were measured for serum samples from 20 patients with chronic hepatitis B and 18 patients with posthepatitic cirrhosis，and the spectra data were analyzed by PCA to reveal the metabonomic changes.Results There were clear metabonomic differences between the patients with chronic hepatitis B and the patients with posthepatitic cirrhosis that could lead to decreased levels in lipids and phosphocholine/choline，and escalating levels of lactate，alanine，methionine，glutamine，creatine and glucose. Conclusion The results showed that the metabolite changes of serum from the patients with posthepatitic cirrhosis were markedly different from those of the patients with chronic hepatitis B，what indicated that 1H NMRand principal component analysisbased metabonomic technique could provide an efficient tool for the diagnosis of posthepatitic cirrhosis at molecular level.

Key words:proton nuclear magnetic resonance; posthepatitic cirrhosis; metabonomics; principal component analysis

核磁共振1H譜(1H nuclear magnetic resonance， 1H NMR)是研究生物樣品(如生物組織/尿液/血液/組織提取液等)代謝組變化的一種很重要的手段，而且這種方法具有良好的客觀性和可重復性，無需對樣品進行特殊處理，可以實現對整個代謝組的同步檢測。肝硬化是影響人類健康的主要疾病之一，慢性乙肝若不能有效控制，可發展為肝硬化，如果能在肝硬化出現早期準確診斷，則會在很大程度上改善肝病的預后[1]。本研究采用磁共振1H譜來研究乙肝后肝硬化患者血清的代謝組特征，結合模式識別分析方法，找出肝硬化出現后代謝組的改變，評價磁共振氫譜用于乙肝后肝硬化診斷的臨床應用價值。

1 材料和方法

1.1 樣品收集 收集南方醫科大學南方醫院感染內科患者血清樣本38例(根據臨床乙肝和乙肝后肝硬化診斷標準[2]，慢性乙肝20例，乙肝后肝硬化18例)，置-80 ℃冰箱貯存備用。

1.2 樣品預處理 1H NMR譜采樣前，將所有血清樣本解凍，在4 ℃下，10 000 g離心 10 min。取300 μL上層血清加至5 mm NMR測試管中，后加入0.2 mol/L 磷酸緩沖溶液(0.2 mol/L Na2HPO40.2 mol/L NaH2PO4，pH=7.4)200 μL 和重水50 μL，振蕩混勻。

1.3 NMR實驗 NMR實驗采用BRUKER Avance 500 MHz 超導核磁共振波譜儀，實驗溫度為298 K。采用CarrPurcellMeiboomGill (CPMG，relaxation delay90(τ180τ)nacquisition)脈沖序列，回波時間2 nτ=100 ms， 4 s延遲時間，10 kHz譜寬，64 k數據點，采集次數為128。傅立葉變化前加0.3 Hz 指數窗函數處理。采用TOPSPIN 2.0軟件進行手動調相和基線校正。化學位移以乳酸甲基雙重峰δ 1.33進行定標。

1.4 1H NMR譜的數據預處理和主成分分析 采用軟件TOPSPIN 2.0對所有1H CPMG譜進行自動積分，積分區間δ0.5～9.0，積分間隔0.02 ppm。為了消除剩余水峰引起的影響，將積分區間δ 4.7～5.2的積分值設為零。此外，為了消除樣本間因濃度不同而帶來的分析誤差，在進行主成分分析之前對各分段積分值進行歸一化處理。歸一化后的數值將作為原始數據導入軟件SIMCAP 10.0 (Umetrics，Sweden)中進行模式識別主成分分析(principal component analysis，PCA)。

2 結果

2.1 乙肝后肝硬化患者血清的磁共振1H譜

圖1是代表性的乙肝后肝硬化患者血清1H CPMG譜，譜峰信號的歸屬

2.2 PCA分析

圖2給出對乙肝患者(●)和乙肝后肝硬化患者(▲)血清1H CPMG譜的主成分分析結果(PC1 vs PC2，R2=72.2%)，分析結果以得分圖和負載圖給出。在得分圖中乙肝患者與乙肝后肝硬化患者血清樣本區分很明顯，兩類不同樣本間的代謝差異可以從負載圖中得到。乙肝后肝硬化患者血清中脂和膽堿/磷酸膽堿的含量是降低的，而乳酸、丙氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、肌酸和葡萄糖的含量則是升高的。

3 討論

磁共振氫譜是一種無創性的檢測體內生化代謝改變的新方法[5]，目前已經應用到多種疾病的分析中，以便更好地研究由于病變所引起的生物體的代謝變化，從而為疾病的診斷提供一種可靠的分子水平上的代謝依據。由于一張1H NMR譜中有很多代謝物信號峰，且代謝物之間存在一定的聯系，所以僅僅憑借肉眼很難全部觀察到這些代謝物的變化，而基于多變量的主成分(PCA)分析方法，是通過對原始譜圖進行降維，然后對所有樣本進行分析，能夠給出不同類型樣本間的代謝差異。通過對乙肝和乙肝后肝硬化病人血清磁共振氫譜的PCA分析表明，這兩組血清的代謝組特征明顯不同，與乙肝患者血清代謝組相比，乙肝后肝硬化引起患者血清中脂和膽堿/磷酸膽堿的含量降低，而乳酸、丙氨酸、谷氨酰胺、肌酸和葡萄糖的含量升高。

血清中脂類物質含量的改變在很多疾病中都有發現[6，7]，它表明肝硬化形成過程中脂代謝發生改變。膽堿是細胞膜的重要組成成分，肝硬化的產生導致血清中膽堿含量降低，這可能與肝細胞結節形成有關，與前人的研究結果類似[8]。葡萄糖的含量在乙肝后肝硬化患者血清中是升高的，這表明肝硬化形成引起血中糖代謝紊亂，糖代謝能力降低。在無氧條件下，葡萄糖會經過糖酵解過程轉變成乳酸，如果人體能量代謝正常，乳酸將會被血液帶至肝臟，進一步分解為水和二氧化碳并產生熱量，血液中乳酸不會堆積。而肝硬化、肝細胞彌散變性會引起肝細胞內乳酸鹽的專運能力降低，肝臟功能受損，造成乳酸鹽堆積[9]，所以肝硬化患者血清中乳酸升高。此外，與乙肝患者血清相比，乙肝后肝硬化患者血清中的谷氨酰胺升高，提示存在體內氨代謝的紊亂。谷氨酰胺是氨的儲存和運輸形式，參與神經遞質活動，肝細胞長期損傷導致其尿素合成障礙，血氨升高，產生更多的谷氨酰胺[1]。所以，肝硬化引起患者血中脂代謝、能量代謝和氨代謝過程的改變。

總之，基于磁共振氫譜和模式識別的代謝組學方法能夠給出乙肝后肝硬化患者血清的代謝特征以及相關的代謝改變，這可以從分子水平去區分乙肝和乙肝后肝硬化，為乙肝后肝硬化的臨床診斷提供可靠的分子水平上的代謝依據。