【摘要】 通過丁二酸酐將失水山梨醇脂肪酸酯(Span80)和聚乙二醇(PEG400)聯接在一起，合成了一種新的非離子表面活性劑。然后將其嫁接在聚乙烯醇(PVA)化的Fe3O4磁性粒子上，合成了一種新型靶向藥物載體。這種載體兼備了Span80/PEG400類脂囊泡和磁性材料的特點，具有良好的穩定性和靶向作用。將這種新型載體用于兩性霉素的包封，包封率可達96.6%，且方法簡便。實驗過程中采用了FTIR， NMR， XRD和TEM等多種手段進行表征。

【關鍵詞】 失水山梨醇脂肪酸酯; 聚乙二醇; 聚乙烯醇; 藥物載體; 磁性粒子

1 引 言

納米微粒四氧化三鐵是一種磁性強、制備相對簡單且生物相容性較好的磁性粒子，是生物醫學領域常采用的磁性載體材料[1]。將有機高分子和這種磁性物質結合后會形成具有一定磁相應性及特殊結構的微球，其既可以通過共價鍵來結合酶[2，3]、細胞[4]等生物活性物質，或作為藥物的載體[5]和固相吸附材料[6～8]等;又可對外加磁場表現出強烈的磁相應性。目前，用于磁性材料的有機高分子主要有殼聚糖[9]、血清白蛋白[10]等。而用非離子表面活性劑改性的磁性材料少有報道[11]。

失水山梨醇脂肪酸酯(Span80)和聚乙二醇(PEG400)復配形成的類脂囊泡可作為藥物助劑，長期穩定存在[12]。本實驗合成了Span80PEG400，將其成功地嫁接在磁性粒子上。將聚乙烯醇(Polyvinyl alcohol， PVA)羧基化(PVAc)，然后將PVAc涂層在磁性粒子表面，制備出一種新型的靶向藥物載體，并將此載體用于兩性霉素的包封，效果良好。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

EQUINX55傅立葉變換紅外光譜儀(德國Bruker公司);UitraShied 300M核磁共振譜儀(瑞士Bruker公司);XPERTPRO X射線衍射儀(荷蘭飛利浦公司); TU1901雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器公司);H800透射電子顯微鏡(日本Hitachi公司)。

聚氧乙烯(20)失水山梨醇單月桂酸酯(Tween 20)、Span80、PEG400、PVA和丁二酸酐為分析純試劑;4二甲氨基吡啶(4DMAP， 99%)，N，N′二環己基碳二亞胺(DCC， 99%)購于上海 Medpep公司;其它試劑均為分析純，實驗用水為去離子水。

2.2 磁性微球的制備

2.2.1 Span80PEG400的合成 取干燥圓底燒瓶，加入反應溶劑二氯甲烷(CH2Cl2) 200 mL，Span80 21.4 g (0.05 mol)，丁二酸酐(Succinic anhydride)15 g(15 mol)，及催化劑4DMAP 6.1 g (0.05 mol)，于65 ℃水浴攪拌下反應12 h。冷卻后抽濾除去未反應的丁二酸酐，旋轉蒸發濾液除去CH2Cl2后得Span80的酯化產物。在200 mL CH2Cl2中，按照摩爾比1∶1∶1∶1分別加入PEG400、Span80的酯化物、DCC及催化劑4DMAP，室溫下磁力攪拌24 h。反應結束后抽濾除去DCC，濾液旋轉蒸發，然后加幾滴四氫呋喃于冰箱中保存過夜。

2.2.2 Span80PEG400嫁接的PVA化磁性粒子制備 稱取適量Span80PEG400倒入三口燒瓶中，加50 mL甲苯為脫水劑，攪拌溶解后，加入適量Fe3O4PVAc，再加入少量H2SO4作催化劑，加熱回流反應3 h后停止。棄去甲苯液，用無水乙醇洗脫粘附在燒瓶壁上的黑色產物，用乙醇沖洗多次后蒸去乙醇，產物置于50 ℃真空干燥后備用。

2.3 新型靶向制劑作為兩性霉素的載體

將Fe3O4PVAcSpan80PEG400和水或者一定濃度的兩性霉素(AmB)的藥物溶液按照質量比1∶99配制，超聲15 min后[12]，各取1.00 mL裝于透析袋中，在25 mL水中透析24 h，測定AmB在407.0 nm處的吸光度，扣除空白的吸收，由工作曲線確定游離藥物的濃度，根據EE(%)=(c總-c游離)/c總×100計算包封率[10]。

3 結果與討論

3.1 磁性靶向載體的合成及表征

3.1.1 Fe3O4PVAc微球的合成及表征 參照文獻[13] 合成了Fe3O4PVAc磁性微球。對比紅外差譜可知，Fe3O4PVAc即具有FeO在570 cm-1左右的特征吸收峰，又含有1617 cm-1的羰基吸收峰和1049 cm-1處的醚鍵的吸收峰， 其結果與文獻[13]相符。此外，在13CNMR中，δ 163.23×10-6的峰確定為PVAc的羰基所致。由此可知，PVAc已成功嫁接在Fe3O4粒子表面。

采用透射電子顯微鏡(TEM)觀察Fe3O4納米粒子及Fe3O4PVAc的微觀形態。由圖1A可見，共沉淀法制備得到的Fe3O4納米粒子主要為球形結構，粒子大小均勻。粒子的直徑約20 nm。其表面包覆后形成的Fe3O4PVAc的形貌見圖1B。包覆后的團聚現象減弱，有部分分散的趨勢。

Fe3O4在XRD圖譜中有6個特征衍射峰(220， 311， 400， 422， 511和440)，這些指標參數在圖2中的兩個譜線里都能觀察到，說明合成的Fe3O4納米微粒具有尖晶石結構，且在表面包覆時無相變現象。

3.1.2 Span80PEG400嫁接的磁性微球的制備及表征 Span80PEG400的合成分為兩步，均為酯化反應，其反應原理如下:

由A和B的分子結構可知，B結構式上多了一個雙羰基(丁二酸酐打開所致)。而反映在FTIR光譜上(未列出)，就是在1740和1850 cm-1之間有雙峰(OCOCH2CH2COOH)。此外，采用1H NMR(CDCl3)對所得產物B的化學結構進行表征，其中，與羰基相連的兩個亞甲基(OCOCH2CH2COOH)的化學位移出現在δ 2.61處，與文獻[13]報道的結果一致，證實了B的存在。產物C的紅外譜圖與B相比，多了1109 cm-1處的νas(COC)和952 cm-1處的νs(COC)。此外，在Span80PEG400的1HNMR(CDCl3)譜圖上(未列出)， δ 4.21處出現的亞甲基源于PEG400，且與琥珀酰基(Succinyl group)相連，而δ 3.56處的峰則為PEG400分子結構中的重復單元。證實了通過丁二酸酐Span80已成功連接上PEG400。在靶向制劑Fe3O4PVAcSpan80PEG400的紅外圖譜中， FeO鍵(570 cm-1)，羰基(1680 cm-1)，特別是醚鍵的(1100～1200 cm-1)峰明顯增強，由此可知已成功制備了改性的磁性微球。

3.2 新型靶向制劑包封兩性霉素及結果分析

兩性霉素是治療深部真菌感染的首選藥物之一，但該藥物具有嚴重毒性，使臨床應用受到很大限制。由此，對這類藥物的包封和控制釋放是提高療效、降低毒副作用最有效的方法。按照2.3節所述方法，用Fe3O4PVAcSpan80PEG400作為兩性霉素藥物的載體進行實驗，為了解其包封效果，需建立在此體系下兩性霉素藥物的檢測方法。由于是磁性載體，在磁場作用下，很容易實現載體與未包封藥物的分離和測定。

3.2.1 脂質體的吸收光譜和標準曲線 以無水乙醇為溶劑配制較低濃度的兩性霉素溶液，以無水乙醇為參比，紫外可見分光光度計在300～700 nm內掃描，在407 nm處出現最大吸收。而空白脂質體和包封藥物的脂質體的紫外吸收光譜表明，在407 nm處測定時，空白脂質體幾乎無吸收，故不影響藥物的測定(見圖3)。 圖3 脂質體和空白脂質體的紫外吸收光譜圖

配制濃度分別為0.5， 1.0， 2.0， 3.0和4.0 mg/L的兩性霉素標準溶液，在407 nm處測定吸光度。以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標進行線性回歸得標準曲線。測定兩性霉素的線性回歸方程為：A=-0.3818+0.08866c(r=0.99883， n=5)。

3.2.2 兩性霉素的包封及誤差分析 當Fe3O4PVAcSpan80PEG400和0.25 g/L兩性霉素(AmB)的藥物溶液按照不同質量體積比配制時，包封率見表1。隨著質量體積比的增加， 包封率也在逐漸增大;但質量體積比達到一定值后再增大，包封率變化不大，最大包封率為96.6%，高于Span80和PEG400制備的囊泡[12]的包封率95.2%。但由于其具有磁鐵靶向性，結果令人滿意。需要說明的是，由于這種新型磁性粒子具有兩性分子的特點，可用于磁性囊泡等的自組裝[15]和作為分離富集的載體等，相關的工作有待于進一步的研究。 表1 在不同質量體積比條件下AmB藥物在Fe3O4PVAcSpan80PEG400中的包封率