作者：楊彩哲，胡家露，徐梁，吳道澄，張學庸

【關鍵詞】 胰島素

關鍵詞 :胰島素;納米粒;糖尿病，實驗性

摘 要:目的 制備氰基丙烯酸正丁酯胰島素納米粒（insulin nanoparticles INP），研究其理化特性，觀察sc和po給藥對糖尿病大鼠的降血糖作用. 方法 用改良的乳液聚合法制備氰基丙烯酸正丁酯胰島素納米粒，用透射電子顯微鏡觀察INP的大小、形態，用高壓液相色譜法（HPLC）測定其包裹率，用ip四氧嘧啶制備糖尿病大鼠模型.血糖用快速血糖儀測定.用t檢驗和χ2 檢驗進行統計學處理. 結果 用改良的乳液聚合法制得的INP粒徑為（30±0.5）nm，包裹率為95%，給糖尿病大鼠sc30U?kg-1 ，INP組1h開始起作用，4～6h達峰值，血糖降低98%，作用持續24h，而普通胰島素組1h達峰值，最大降血糖幅度為55%，作用持續4h.sc20U?kg-1 ，INP組1h開始起作用，4～6h達峰值，最大降血糖幅度為74%，作用持續20h，而魚精蛋白鋅胰島素組1h開始起作用，4～6h達峰值，最大降血糖幅度為41%，作用也持續20h.給糖尿病大鼠po INP120U?kg-1 ，1d后空腹血糖開始下降，3d效果最佳，血糖降低89%，5～7d后恢復高血糖，而po普通胰島素組血糖無明顯變化，2～4d的血糖兩組比較相差顯著P<0.05）.50U?kg-1 組及100U?kg -1 組作用持續時間均為5d，120U?kg-1 組的作用時間為7d.三個劑量組最大降糖作用均在服藥后3d.120U?kg-1 組與100U?kg -1 組1～5d的BDGP相差顯著（P<0.05），100U?kg-1 組與50U?kg -1 組3d時的BGDP相差顯著（P<0.05）. 結論 胰島素包入納米粒后生物活性保存良好，sc后有緩釋作用，po后有降血糖作用.

Keywords:insulin;nanoparticles;diabetes mellitus，experi-mental

Abstract:AIM To investigate the characteristics of insulin-nanoparticles（INP）and their hypoglycemic effect on the al-loxan-induced diabetic rats.METHODS INP was prepared by improved emulsion polymerization methods.The entrap-ment efficiency was measured by HPLC.The diabetic rats were induced by ip alloxan.RESULTS INP thus prepared was（30±0.5）nm in diameter with an entrapment efficiency95%.Subcutaneously administrated INP to alloxan-induced diabetic rats at a dose of30U?kg-1 induced98%decrease of blood glucose at4～6h.The effect lasted for24h.Whereas the regular insulin hypoglycemic effect lasted only for2～3h with the strongest hypoglycemic effect of55%at1h.Subcu-taneously administrated INP at a dose of20U?kg-1 to allox-an-induced diabetic rats induced74%decrease of blood glu-cose at4～6h and the effect lasted for20h.The protamine zine insulin effect lasted for the same time with the strongest hypoglycemic effect of41%at4～6h.When a single dose of INP at120U?kg-1 was given intragastrically（orally）to the diabetic rats，the blood glucose began to drop on the first day，the strongest hypoglycemic effect（about89%decrease of blood glucose）being observed on the third day.The hy-poglycemic effect was maintained for4～5d.After5～7d blood glucose returned to the control values.The regular in-sulin rendered no effect on blood glucose after intragastric ad-minstration（P<0.05）.The dose-dependency was observed in both hypoglycemic effect and maintaining time with differ-ent doses of oral INP.CONCLUSION INP can preserve the biological activities of insulin very well.When subcutaneous-ly administered to alloxan-induced diabetic rats，INP has a prolonged hypoglycemic effect.Oral administration of INP also exerts a dose-dependent hypoglycemic effect on experi-mental diabetes.INP might be of potential oral use for in-sulin.

0 引言

po胰島素是糖尿病患者的迫切愿望，也是國內外醫藥工作者研究的熱點之一［1-5］ .胰島素屬肽類藥物，po后易被胃腸道蛋白水解酶降解，故其po給藥問題一直未能解決.納米粒（nanoparticles NP）是一種直徑為10～1000nm，活性成份包封、鑲嵌或吸附于粒子之上的膠體分散系統［6］ ，因其具有緩釋、靶向性、可提高生物利用度、降低不良反應、可保護肽類藥物避免蛋白酶的降解等優點而受到重視［7-14］ ，制備NP的材料有明膠、白蛋白、丙烯酰胺、丙烯酸酯等，近年來氰基丙烯酸酯類（Alkylcyanoacrylates ACA）因具有在水介質中快速聚合、毒性低、可生物降解等優點而倍受青睞［6］ .我們用氰基丙烯酸正丁酯（butylcyanoacrylate BCA）作原料，制備了氰基丙烯酸酯胰島素納米粒（insulin-nanoparticles INP），研究其特性，觀察po及sc給藥對四氧嘧啶糖尿病大鼠的降血糖作用.

1 材料和方法

1.1 材料

胰島素注射液購自上海生化制藥廠，四氧嘧啶購自Sigma公司，氰基丙烯酸正丁酯購自西安實用膠研究所，SD雄性大鼠購自第四軍醫大學實驗動物中心，高壓液相色譜儀是日本島津公司產品，GT-4310型葡萄糖測定儀由桂林醫療電子儀器廠與日本京都株式會社合作生產，JEM-2000EX型透射電子顯微鏡是日本產品.

1.2 方法

胰島素納米粒的制備采用改良的乳液聚合法制備氰基丙烯酸酯胰島素納米粒，主要步驟:取蒸餾水60mL，加入0.2g非離子表面活性劑，普通胰島素溶液20mL（40kU?L-1 ），適量的a-氰基丙烯酸正丁酯（BCA），反應1～2h，得到半透明的膠體溶液，即為胰島素納米粒膠體溶液.采用電子顯微鏡負染法觀察納米粒的大小及形態.用50g?L-1 的醋酸鈾溶液染色后，用透射電子顯微鏡觀察（放大4～10萬倍）.胰島素包裹率的測定用高效液相色譜法.胰島素納米粒用蒸餾水充分透析后，分別取透析前后的胰島素等體積，用適量的乙腈溶解INP至透明的溶液，用高效液相色譜儀測定胰島素含量.層析柱的填料為十八烷基硅烷鍵合硅膠，流動相為pH值2.0的0.1mol?L-1 磷酸鹽緩沖液與乙腈按7/3比例混合而成的溶液.胰島素的標準液用上海生化制藥廠生產的胰島素注射液.包裹率=透析后胰島素濃度/透析前胰島素濃度×100%.將新制備的胰島素納米粒置離心管中，以15000r?min-1 離心60min，觀察納米粒有無分層、聚結或沉淀的現象.4℃放置5mo觀 察有無分層、聚結等現象.體質量約200g的SD雄性大鼠，購自本校實驗動物中心，在本實驗室飼養5d，禁食24h，飲水不限，ip新鮮配制的50g?L-1 四氧嘧啶生理鹽水溶液175mg?kg-1 ，分別于給藥后1，2，3，7和14d自尾尖取血測定血中葡萄糖濃度.2wk后空腹10h血糖大于16.7mmol?L-1 的大鼠被認為是糖尿病大鼠［3］ .糖尿病大鼠隨機分為3組，每組4只，分別sc同等劑量的胰島素納米粒（INP）、普通胰島素（RI）或魚精蛋白鋅胰島素（PZI），對照組用等量生理鹽水（CONTR）.給藥后1，2h及其后每間隔2h自尾尖取血，測血糖水平，直至血糖全部恢復至用藥前水平.每個血糖值換算為血糖下降百分數（blood glucose decrease percentage BGDP）.

BGDP=用藥前血糖值-用藥后血糖值用藥前血糖值 ×100% 每組各時間點的BGDP用x ±s表示，并用χ2 檢驗分析每組各時間點與對照組比較差異是否顯著.糖尿病大鼠隨機分為3組，每組8只，分別用INP，FI及生理鹽水（NS）ig.胰島素的劑量分別為50，100，120U?kg-1 于給藥前、后24，48h連續測血糖至給藥前水平.每組各時間點的血糖或BGDP用x ±s表示，并用t檢驗或χ2 檢驗分析每組各時間點血糖是否差異顯著.

2 結果

2.1 INP的特性

用改良的乳液聚合法制得的氰基丙烯酸酯胰島素納米粒為園形或卵園形，直徑約30nm，形態見Fig1，用HPLC測得的包裹率為95%.普通的胰島素及INP包裹的胰島素HPLC的洗脫峰出現時間無明顯差異.INP以15000r?min-1 速度離心60min未見分層及沉淀.INP在4℃存放5mo未見分層及沉淀等現象.

2.2 INP的降血糖作用

將INP30U?kg-1 給大鼠sc后1h大鼠血糖開始下降，4h達峰值，最大降血糖幅度為98%，作用持續24h，于用藥后24h恢復至用藥前水平，sc未包裹的正規胰島素30U?kg-1 ，血糖在用藥后1h下降幅度最大達55%，療效維持3h，用藥后4h血糖恢復至用藥前血糖水平.同樣劑量（20U?kg-1 ）的INP和PZI給糖尿病大鼠sc后，兩組的降血糖作用均在1h起作用，4～6h達到最大降血糖作用，但是兩組最大降血糖幅度分別為74%和41%，差異顯著（P<0.05，Tab1，2），作用持續時間相同約為20h.給糖尿病大鼠po給藥INP120U?kg-1 ，于服藥后1d空腹血糖開始下降，3d作用最強，血糖下降率達89%，7d血糖恢復到給藥前水平（Fig2）.po等量RI及生理鹽水組血糖無明顯變化.INP組與RI組比較，2～4d的血糖差異非常顯著（P<0.01，Fig2）.不同劑量INP給糖尿病大鼠po后的降血糖作用結果見Tab3. 表1 INP sc30U?kg（略） 表2 INP sc20U?kg（略）表3 poINP對糖尿病大鼠的降血糖作用（略）

3 討論

我們利用改良的乳液聚合法制備的INP，經HPLC檢測，INP中的胰島素與普通胰島素HPLC

洗脫峰出現時間是一致的，說明用改良的乳液聚合法 制備的INP中胰島素的結構未受影響.我們制備的INP包裹率達95%.Zhang等［13］ 用乳液聚合法制備的氰基丙烯酸正丁酯無環鳥苷納米粒，包裹率僅18%.Damge等［3］ 用界面聚合法得到的INP的包裹率98%，但界面聚合法需大量有機溶劑，工藝復雜.我們建立的改良的乳液聚合法工藝簡單易行，便于INP的大規模生產，我們制備的INP直徑30nm，比Damage等用界面聚合法得到的粒徑為200nm小得多，更易于INP在腸道的吸收. 給糖尿病大鼠sc INP后，有明顯的降血糖作用，說明胰島素包入NP后，胰島素的生物活性保持良好.INP的降血糖作用與同劑量的普通胰島素相比，作用時間明顯延長.普通胰島素（30U?kg-1 ）sc給藥后1h降糖作用達高峰，作用持續約4h.而同等劑量的INPsc給藥后，1h開始起作用，4～6h降糖作用達高峰，作用持續約24h，說明INP有緩釋作用.同等劑量（30U?kg-1 ）的RI及INPsc后，最大降糖百分數分別為55%和98%，INP的降血糖作用比同劑量的RI相比明顯增強，結果說明INP可以提高生物利用度.RIsc給藥，受局部酶類的破壞，因此只是部分發揮降血糖作用.INPsc后，其中的胰島素受NP的保護，避免局部酶類的降解，使進入體內的INP充分發揮降血糖作用.INPsc給藥后，隨著劑量的加大，INP降血糖作用加強，作用時間也顯著延長.Damge等［3］ 用氰基丙烯酸異丁酯制得INP，以25U?kg -1 給糖尿病及正常大鼠sc，其降血糖效果可以持續20～22h，隨著劑量的增大，降血糖作用也增強，作用時間也明顯延長.本結果與文獻一致.INPsc后，其作用時間明顯延長，可能是由于納米粒中被包裹胰島素緩慢釋放.Damge等及Couvreur［6］ 認為是由于酯酶對聚氰基丙烯酸酯的酯側鏈水解引起的生物降解，使包裹的藥物逐漸自INP中釋放出來.Lavelle［14］ 也認為被包裹的藥物通過納米粒上的孔隙，被動彌散出來.

INP按120U?kg-1 給糖尿病大鼠ig，于服藥后1d空腹血糖開始下降，2d降至正常，3d達到最大療效，降血糖幅度達89%，維持正常血糖3d，7d血糖恢復給藥前水平，而po等量普通胰島素及生理鹽水組血糖無明顯變化，說明包入NP的胰島素給糖尿病大鼠po后，能逃避胃腸道蛋白分解酶的破壞，直接被腸道吸收，發揮降血糖作用.有作者［10］ 曾將胰島素吸附在NP表層，給大鼠po，無降血糖作用.Damge等［3］ 將直徑為200nm的INP以100U?kg-1 給糖尿病大鼠po，其降血糖幅度約59%，作用維持22d.我們將直徑為30nm的INP一次給大鼠po100U?kg－1 ，其最大降糖幅度為74%.這可能是由于小的INP降解過程所需時間比大的INP要短，而使胰島素釋放在相對較短時間內較集中完成.

關于INP在胃腸道的吸收機制尚未闡明，有作者認為［4］ NP進入腸腔后，釋放胰島素至腸腔，多數在腸腔內被酶類降解，少數被吸收進入體循環而發揮作用.William等［5］ 認為胰島素進入胃腸道后，可能與胃腸道上皮細胞表面的胰島素受體結合，而減少葡萄糖在腸道的吸收，使血糖下降的.多數學者［3，6，12］ 認 為納米粒可以完整吸收.胃腸道攝取INP有三種可能的途徑［6］ :①被腸上皮細胞攝取至細胞內;②通過細胞間轉運;③經Peyer’s結的M細胞的攝取.納米粒在胃腸道的吸收除了與粒徑的大小、組成成分、表面的親水性、表面電荷等粒子本身的特性有關外［15］ ，還受其他因素影響，最近有學者［16，17］ 發現用維生素B12修飾后，可以促進納米粒吸收.血管內皮細胞生長因子可以促進血管對納米粒的跨細胞轉運［18］ ，進一步研究INP在胃腸道的吸收機制，設計po生物利用度高的胰島素劑型，爭取早日進入臨床.

［1］Yang CZ，Hu JL，Zhang ZB，Xu L，Wu DC，Zhao BQ，Zhang XY.Preparation of insulin-nanocapsules and their therapeutic effect on experimental diabetic rats oral administration［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1994;15（1）:65-66.

［2］Carino GP，Jacob JS，Mathiowitz E.Nanosphere based oral in-sulin delivery［J］.J Controlled Release，2000;65（1-2）:261-269.

［3］Damge C，Vranckx H，Balschmidt P，Couvreur P.Polyalkyl-cyanoacrylate nanospheres for oral administration of insulin［J］.J Pharm Sci，1997;86（12）;1403-1409.

［4］Morishita.M，Morishita.I，Takayama.k，Machida.Y，Nagai，T.Novel oral microspheres of insulin with protease inhibitor pro-tecting from enzymatic degradation［J］.Int J Pharm，1992;78:1-7.

［5］William F.and Saffran M.Insulin in the drinking water of rats ［J］.Drug Delivery，1996;3:81-85.

［6］Couvreur P.Nano-and microparticles for the delivery of polypeptides and proteins［J］.Adv Drug Deliv Revi，1993;10:141-162.

［7］Fattal E，Vauthier C，Aynie I，Nakada Y，Lambert G，Malvy C，Couvreur P.Biodegradable polyalkylcyanoacrylate nanoparti-cles for the delivery of oligonucleotides［J］.J Controlled Re-lease，1998;53（1-3）:137-143.

［8］Gibaud S，Rousseau C，Weingarten C，Favier R，Douay L，An-dreux JP，Couvreur P.Polyalkylcyanoacrylate nanoparticles as carriers for granulocyte-colony stimulating factor（GιCSF）［J］.J Controlled Release，1998;52（1-2）:131-139.

［9］Kawashima Y，Yamamoto H，Takeuchi H，Fujioka S，Hino T.Pulmonary delivery of insulin with nebulized DL-lactide/glycol-ide copolymer（PLGA）nanospheres to prolong hypoglycemic ef-fect［J］.J Controlled Release，1999;62（1-2）:279-287.

［10］Ghirardelli R，Bonasoro F，Porta C，Cremaschi D.Identifica-tion of particular epithelial areas and cells that transport polypeptide-coated nanoparticles in the nasal respiratory mucosa of the rabbit［J］.Biochim Biophys Acta，1999;1416（1-2）:39-47.

［11］Chen JH，Wang ZM，Wu DC，Xu SD，Chen HW，Wen AD.Early dynamical body distribution of nanoparticle-associated adriamycin after administration into the hepatic artery of rats de-termined with HPLC technique［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（1）:89-91.

［12］ Lowe PJ，Temple CS.Calcitonin and insulin in isobutyl-cyanoacrylate nanocapsules:Protection against proteases and ef-fect on intestinal absorption in rats［J］.J Pharm Pharmacol，1994;46:547-552.

［13］Zhang Z，Tian H，He Q.Preparation of acyclovir-polybutyl-cyanoacrylate-nanoparticles by emulsion polymerization method ［J］.Hua Hsi I Ko Ta Hsueh Hsueh Pao（J West China Med Univ），1998;29（3）:329-333.

［14］Lavelle EC，Sharif S，Thomas NW.The importance of gastroin-testinal uptake of particles in the design of oral delivery systems ［J］.Adv Drug Deliv Revi，1995;18;5-22.

［15］Jung T，Kamm W，Breitenbach A，Kaiserling E，Xiao JX，Kissel T.Biodegradable nanoparticles for oral delivery of pep-tides:Is there a role for polymers to affect mucosal uptake［J］?

Eur J Pharm Biopharmicol，2000;50（1）:147-160.

［16］Russell GJ，Arthur L，Walker H.Vitamin B12-mediated trans-port of nanoparticles across Caco-2cells［J］.IntJ Pharm，1999;179（2）:247-255.

［17］Russell GJ.Use of vitamin B12conjugates to deliver protein drugs by the oral route［J］.Crit Rev Ther Drug Carrier Syst，1998;15（6）:557-586.

［18］Monsky WL，Fukumura D，Gohongi T，Ancukiewcz M，Weich HA，Torchilin VP，Yuan F，Jain RK.Augmentation of transvascular transport of macromolecules and nanoparticles in tumors using vascular endothelial growth factor［J］.Cancer Res，1999;59（16）:4129-4135.