作者：鐘振國(guó)，李學(xué)堅(jiān)，董明姣，劉布鳴，陳明生，

林霄，韋燕飛，韋勇漢，陸盛勝，黃金蘭，羅雪菲，鐘益寧

【摘要】 目的對(duì)余甘子葉中槲皮素進(jìn)行分析研究，建立定性定量分析方法，為余甘子葉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供方法和依據(jù)。方法采用薄層色譜進(jìn)行定性鑒別;采用液相色譜測(cè)定余甘子葉中槲皮素的含量：色譜柱為C18柱，流動(dòng)相為甲醇-0.2%磷酸(50∶50)，流速1.0 ml/min ，檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm，外標(biāo)法定量。結(jié)果槲皮素在10～100 μg/ml范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，平均回收率為101.0%(RSD=1.89%，n=9);分別對(duì)不同產(chǎn)地的樣品進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)論該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性、回收率好，可作為余甘子葉藥材的質(zhì)量控制方法。

【關(guān)鍵詞】 余甘子葉;槲皮素;薄層色譜;液相色譜

余甘子葉為大戟科葉下珠屬植物余甘子Phyllanthus embllca L.的葉，余甘子樹廣泛分布于我國(guó)的廣西、廣東、福建、貴州、云南等地。余甘子為傳統(tǒng)民族用藥，具有清熱涼血、消食健胃、生津止咳之功效，用于治療血熱血淤、消化不良、腹脹、咳嗽、喉痛、口干[1]。余甘子中含槲皮素[2]，但對(duì)余甘子葉未見(jiàn)研究報(bào)道。我們研究發(fā)現(xiàn)余甘子葉中也含槲皮素，本實(shí)驗(yàn)采用薄層色譜法和液相色譜法，以槲皮素為對(duì)照，對(duì)余甘子葉進(jìn)行了定性定量分析方法研究，并對(duì)不同產(chǎn)地的樣品進(jìn)行了分析比較，為該植物的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供基礎(chǔ)化學(xué)數(shù)據(jù)，為余甘子葉藥材及其制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究奠定基礎(chǔ)和依據(jù)。

1儀器與材料

1儀器與試藥

美國(guó)Waters 515 HPLC Pump、2487 DualλAbsorbance Detector液相色譜儀，威瑪龍色譜工作站;KQ5200B型超聲清洗器;硅膠G，青島海洋化工廠;槲皮素對(duì)照品(756-200211，由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，供含量測(cè)定用);水為超純水，甲醇為色譜純;其它試劑均為分析純。

1.2樣品余甘子葉采自廣西各地，經(jīng)廣西中醫(yī)學(xué)院劉壽養(yǎng)教授鑒定為大戟科葉下珠屬植物余甘子Phyllanthus Embllca L.的葉，晾干。

2方法與結(jié)果

2.1薄層色譜鑒別取余甘子葉粉碎，稱取1 g，加70%乙醇50 ml水浴回流1 h，取出，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)?0 ml水充分溶解，濾過(guò)，濾液用乙醚萃取2次，30 ml/次，棄乙醚層，水溶液加5 ml稀鹽酸回流1 h，取出，用冷水立刻冷卻，濾過(guò)，濾液再用乙醚萃取2次，30 ml/次，收集乙醚提取液，濾過(guò)，蒸干，殘?jiān)?ml醋酸乙酯溶解，作為供試品溶液。作另取余甘子葉對(duì)照藥材同法制成對(duì)照藥材溶液。再取槲皮素對(duì)照品，加甲醇制成毫升含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法[3]試驗(yàn)，吸取上述各種溶液各1～2 μl，分別點(diǎn)于同一含羧甲基纖維素納為黏合劑的硅膠G薄層板上，以甲苯-醋酸乙酯-甲酸(5∶2∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出晾干，噴以2%AlCl3乙醇溶液，105℃烘至顯色，置365 nm燈下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同的黃色熒光斑點(diǎn)，Rf=0.45，見(jiàn)圖1。經(jīng)多批樣品試驗(yàn)，薄層色譜的重復(fù)性好，可作為余甘子葉的定性鑒別方法。1、2、3.余甘子葉4.槲皮素對(duì)照品5.余甘子葉藥圖1薄層色譜圖

2.2含量測(cè)定

2.2.1液相色譜測(cè)試條件色譜柱為迪馬C18柱，流動(dòng)相為甲醇-0.2%磷酸(50∶50)，流速1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm，柱溫室溫，進(jìn)樣量10 μl。

2.2.2色譜條件與系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)波長(zhǎng)：取槲皮素對(duì)照品適量，以流動(dòng)相為溶劑，用紫外分光光度計(jì)在200～450 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，測(cè)得槲皮素最大吸收波長(zhǎng)為360 nm，故檢測(cè)波長(zhǎng)選擇360 nm，與文獻(xiàn)報(bào)道槲皮素的檢測(cè)波長(zhǎng)相同[3]。系統(tǒng)適用性：在本色譜條件下，理論板數(shù)按槲皮素峰計(jì)算不低于4 000，槲皮素峰與相鄰組分色譜峰達(dá)到完全分離，分離度大于1.5，槲皮素保留時(shí)間約為16 min。樣品與對(duì)照品色譜見(jiàn)圖2~3。圖2槲皮素對(duì)照品色譜圖

2.2.3提取條件的選擇取同一批余甘子葉，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入5%鹽酸的甲醇溶液25 ml，稱量，超聲1 h，補(bǔ)重，過(guò)濾，水浴蒸干，加甲醇溶解至25 ml量瓶定容，用微孔濾膜(0.45 m)過(guò)濾取續(xù)濾液，得供試品1。同法系列加入30%甲醇，50%甲醇，70%甲醇，甲醇各25 ml，得供試品2，3，4，5。采用HPLC法測(cè)得供試品中槲皮素的含量，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明用5%鹽酸甲醇溶液超聲1 h提取，對(duì)余甘子葉中槲皮素提取效果最好。圖3余甘子葉供試品色譜圖表1余甘子葉不同提取條件測(cè)定結(jié)果

2.2.4溶液制備對(duì)照品溶液的制備：精密稱取10 mg槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品，置于10 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為儲(chǔ)備液;精密吸取儲(chǔ)備液0.4 ml，置于10 ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為槲皮素對(duì)照品溶液(40 μg/ml)。供試品溶液的制備：精密稱取余甘子葉藥材粉末0.2g，置50 ml錐形瓶中，精密加入5%鹽酸的甲醇溶液25 ml，稱量，超聲1 h，用5%鹽酸的甲醇溶液補(bǔ)重，過(guò)濾，水浴蒸干，加甲醇溶解至25ml量瓶中，定容至刻度，用微孔濾膜(0.45 m)濾過(guò)，作為供試品溶液。

2.2.5線性關(guān)系考察分別精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ml置于10 ml量瓶中，定容后搖勻，得10，20，40，60，80，100 μg/ml系列濃度對(duì)照溶液，按上述色譜條件分別注入色譜儀10μl，測(cè)定槲皮素峰面積，以槲皮素峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，以槲皮素進(jìn)樣濃度(X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并求得槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=85 266X+154 568(n=6)，r=0.999 8，表明槲皮素進(jìn)樣的濃度在10~100 μg/ml范圍呈良好的線性關(guān)系。

2.2.6精密度實(shí)驗(yàn)分別取對(duì)照品溶液和供試品溶液，各連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定樣品中槲皮素峰面積積分值并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，測(cè)得對(duì)照品溶液平均值為：3 258 144，RSD=0.60%;供試品溶液平均值為：4 097 378，RSD=1.62%。

2.2.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取供試品溶液，在上述色譜條件下，10 h內(nèi)間隔一定時(shí)間進(jìn)樣，測(cè)定樣品中槲皮素峰面積積分值并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，測(cè)得平均值為：4 129 149，RSD=1.47%。

2.2.8重復(fù)性實(shí)驗(yàn)精密稱取同一批余甘子葉樣品各6份，按“供試品溶液的制備”項(xiàng)下進(jìn)行操作，測(cè)定槲皮素的含量(mg/g)并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果測(cè)得槲皮素平均含量為7.008 7 mg/g，RSD=1.75%(n=6)。

2.2.9加樣回收率實(shí)驗(yàn)分別精密稱取已測(cè)知槲皮素含量(7.0087 mg/g)的余甘子葉粉末樣品，共9份，每份0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，按低(0.607 2 mg)、中(0.708 4 mg)、高(0.809 6 mg)3個(gè)不同的加入量，精密加入槲皮素對(duì)照品溶液(1.012 mg/ml)。混勻后按供試品溶液制備和槲皮素含量測(cè)定方法提取、測(cè)定，計(jì)算平均回收率，結(jié)果平均回收率為101.0%，RSD=1.89%。

2.2.10樣品測(cè)定取不同產(chǎn)地余甘子葉樣品，按上述方法進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表2。表2余甘子葉中槲皮素含量測(cè)定結(jié)果

3討論

本實(shí)驗(yàn)建立了余甘子葉中槲皮素的定性定量分析方法，方法簡(jiǎn)便、快速，專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好，可作為余甘子葉的質(zhì)量控制方法。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了不同產(chǎn)地的余甘子葉，結(jié)果均能檢出槲皮素，但含量有所差異，且相差較大。流動(dòng)相的配比對(duì)槲皮素的色譜峰有較大影響，甲醇-0.2%磷酸為60∶40時(shí)，槲皮素出峰時(shí)間較快，樣品中槲皮素峰未能與其他雜質(zhì)峰有較好地分離;甲醇-0.2%磷酸為50∶50時(shí)，槲皮素出峰時(shí)間相對(duì)較慢，但與相鄰峰的分離效果最好，色譜峰形對(duì)稱，因此選擇50∶50的流動(dòng)相配比。