作者：鐘振國，李學堅，董明姣，劉布鳴，陳明生，

林霄，韋燕飛，韋勇漢，陸盛勝，黃金蘭，羅雪菲，鐘益寧

【摘要】 目的對余甘子葉中槲皮素進行分析研究，建立定性定量分析方法，為余甘子葉的質量標準制定提供方法和依據。方法采用薄層色譜進行定性鑒別;采用液相色譜測定余甘子葉中槲皮素的含量：色譜柱為C18柱，流動相為甲醇-0.2%磷酸(50∶50)，流速1.0 ml/min ，檢測波長為360 nm，外標法定量。結果槲皮素在10～100 μg/ml范圍內呈線性關系，平均回收率為101.0%(RSD=1.89%，n=9);分別對不同產地的樣品進行了測定。結論該方法簡便、準確，專屬性強，重現性、回收率好，可作為余甘子葉藥材的質量控制方法。

【關鍵詞】 余甘子葉;槲皮素;薄層色譜;液相色譜

余甘子葉為大戟科葉下珠屬植物余甘子Phyllanthus embllca L.的葉，余甘子樹廣泛分布于我國的廣西、廣東、福建、貴州、云南等地。余甘子為傳統(tǒng)民族用藥，具有清熱涼血、消食健胃、生津止咳之功效，用于治療血熱血淤、消化不良、腹脹、咳嗽、喉痛、口干[1]。余甘子中含槲皮素[2]，但對余甘子葉未見研究報道。我們研究發(fā)現余甘子葉中也含槲皮素，本實驗采用薄層色譜法和液相色譜法，以槲皮素為對照，對余甘子葉進行了定性定量分析方法研究，并對不同產地的樣品進行了分析比較，為該植物的進一步開發(fā)利用提供基礎化學數據，為余甘子葉藥材及其制劑的質量標準研究奠定基礎和依據。

1儀器與材料

1儀器與試藥

美國Waters 515 HPLC Pump、2487 DualλAbsorbance Detector液相色譜儀，威瑪龍色譜工作站;KQ5200B型超聲清洗器;硅膠G，青島海洋化工廠;槲皮素對照品(756-200211，由中國藥品生物制品檢定所提供，供含量測定用);水為超純水，甲醇為色譜純;其它試劑均為分析純。

1.2樣品余甘子葉采自廣西各地，經廣西中醫(yī)學院劉壽養(yǎng)教授鑒定為大戟科葉下珠屬植物余甘子Phyllanthus Embllca L.的葉，晾干。

2方法與結果

2.1薄層色譜鑒別取余甘子葉粉碎，稱取1 g，加70%乙醇50 ml水浴回流1 h，取出，濾過，濾液蒸干，殘渣加40 ml水充分溶解，濾過，濾液用乙醚萃取2次，30 ml/次，棄乙醚層，水溶液加5 ml稀鹽酸回流1 h，取出，用冷水立刻冷卻，濾過，濾液再用乙醚萃取2次，30 ml/次，收集乙醚提取液，濾過，蒸干，殘渣用1ml醋酸乙酯溶解，作為供試品溶液。作另取余甘子葉對照藥材同法制成對照藥材溶液。再取槲皮素對照品，加甲醇制成毫升含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法[3]試驗，吸取上述各種溶液各1～2 μl，分別點于同一含羧甲基纖維素納為黏合劑的硅膠G薄層板上，以甲苯-醋酸乙酯-甲酸(5∶2∶1)為展開劑，展開，取出晾干，噴以2%AlCl3乙醇溶液，105℃烘至顯色，置365 nm燈下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應的位置上顯相同的黃色熒光斑點，Rf=0.45，見圖1。經多批樣品試驗，薄層色譜的重復性好，可作為余甘子葉的定性鑒別方法。1、2、3.余甘子葉4.槲皮素對照品5.余甘子葉藥圖1薄層色譜圖

2.2含量測定

2.2.1液相色譜測試條件色譜柱為迪馬C18柱，流動相為甲醇-0.2%磷酸(50∶50)，流速1.0 ml/min，檢測波長360 nm，柱溫室溫，進樣量10 μl。

2.2.2色譜條件與系統(tǒng)適用性實驗檢測波長：取槲皮素對照品適量，以流動相為溶劑，用紫外分光光度計在200～450 nm波長范圍內掃描，測得槲皮素最大吸收波長為360 nm，故檢測波長選擇360 nm，與文獻報道槲皮素的檢測波長相同[3]。系統(tǒng)適用性：在本色譜條件下，理論板數按槲皮素峰計算不低于4 000，槲皮素峰與相鄰組分色譜峰達到完全分離，分離度大于1.5，槲皮素保留時間約為16 min。樣品與對照品色譜見圖2~3。圖2槲皮素對照品色譜圖

2.2.3提取條件的選擇取同一批余甘子葉，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入5%鹽酸的甲醇溶液25 ml，稱量，超聲1 h，補重，過濾，水浴蒸干，加甲醇溶解至25 ml量瓶定容，用微孔濾膜(0.45 m)過濾取續(xù)濾液，得供試品1。同法系列加入30%甲醇，50%甲醇，70%甲醇，甲醇各25 ml，得供試品2，3，4，5。采用HPLC法測得供試品中槲皮素的含量，結果見表1。結果表明用5%鹽酸甲醇溶液超聲1 h提取，對余甘子葉中槲皮素提取效果最好。圖3余甘子葉供試品色譜圖表1余甘子葉不同提取條件測定結果

2.2.4溶液制備對照品溶液的制備：精密稱取10 mg槲皮素標準品，置于10 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為儲備液;精密吸取儲備液0.4 ml，置于10 ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為槲皮素對照品溶液(40 μg/ml)。供試品溶液的制備：精密稱取余甘子葉藥材粉末0.2g，置50 ml錐形瓶中，精密加入5%鹽酸的甲醇溶液25 ml，稱量，超聲1 h，用5%鹽酸的甲醇溶液補重，過濾，水浴蒸干，加甲醇溶解至25ml量瓶中，定容至刻度，用微孔濾膜(0.45 m)濾過，作為供試品溶液。

2.2.5線性關系考察分別精密吸取對照品儲備液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ml置于10 ml量瓶中，定容后搖勻，得10，20，40，60，80，100 μg/ml系列濃度對照溶液，按上述色譜條件分別注入色譜儀10μl，測定槲皮素峰面積，以槲皮素峰面積(Y)為縱坐標，以槲皮素進樣濃度(X)為橫坐標，繪制標準曲線并求得槲皮素標準曲線回歸方程為Y=85 266X+154 568(n=6)，r=0.999 8，表明槲皮素進樣的濃度在10~100 μg/ml范圍呈良好的線性關系。

2.2.6精密度實驗分別取對照品溶液和供試品溶液，各連續(xù)重復進樣6次，測定樣品中槲皮素峰面積積分值并計算相對標準偏差，測得對照品溶液平均值為：3 258 144，RSD=0.60%;供試品溶液平均值為：4 097 378，RSD=1.62%。

2.2.7穩(wěn)定性實驗取供試品溶液，在上述色譜條件下，10 h內間隔一定時間進樣，測定樣品中槲皮素峰面積積分值并計算相對標準偏差，測得平均值為：4 129 149，RSD=1.47%。

2.2.8重復性實驗精密稱取同一批余甘子葉樣品各6份，按“供試品溶液的制備”項下進行操作，測定槲皮素的含量(mg/g)并計算相對標準偏差，結果測得槲皮素平均含量為7.008 7 mg/g，RSD=1.75%(n=6)。

2.2.9加樣回收率實驗分別精密稱取已測知槲皮素含量(7.0087 mg/g)的余甘子葉粉末樣品，共9份，每份0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，按低(0.607 2 mg)、中(0.708 4 mg)、高(0.809 6 mg)3個不同的加入量，精密加入槲皮素對照品溶液(1.012 mg/ml)。混勻后按供試品溶液制備和槲皮素含量測定方法提取、測定，計算平均回收率，結果平均回收率為101.0%，RSD=1.89%。

2.2.10樣品測定取不同產地余甘子葉樣品，按上述方法進行含量測定。結果見表2。表2余甘子葉中槲皮素含量測定結果

3討論

本實驗建立了余甘子葉中槲皮素的定性定量分析方法，方法簡便、快速，專屬性強，重現性好，可作為余甘子葉的質量控制方法。本實驗測定了不同產地的余甘子葉，結果均能檢出槲皮素，但含量有所差異，且相差較大。流動相的配比對槲皮素的色譜峰有較大影響，甲醇-0.2%磷酸為60∶40時，槲皮素出峰時間較快，樣品中槲皮素峰未能與其他雜質峰有較好地分離;甲醇-0.2%磷酸為50∶50時，槲皮素出峰時間相對較慢，但與相鄰峰的分離效果最好，色譜峰形對稱，因此選擇50∶50的流動相配比。