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核磁共振電信號內標法在人體尿液定量分析中的應用

佚名

作者:楊亮, 茹閣英, 唐惠儒 劉朝陽

【摘要】 研究了Varian譜儀核磁共振電信號內標法在人體尿液代謝物濃度測定上的應用,通過實驗證明了該方法進行定量分析的可靠性。NMR電信號內標法原理上是通過Varian譜儀去耦通道在常規一維譜圖上產生一個參考信號,并利用譜儀軟件程序來調整該信號在頻譜上的強度、頻率、衰減速率等參數。避免了代謝組學中NMR定量實驗需要添加已知濃度物質(例如TSP)作為內標而引起的內標物與樣品相互作用、譜峰重疊、內標物不溶及弛豫時間太長等問題。研究結果表明,Varian譜儀去耦通道產生的電信號穩定可靠(標準偏差0.36%),能夠用于定量分析;當樣品濃度大于20 mmol/L或小于2 mmol/L時,該方法測定的相對誤差分別為1%和5%。通過配制低濃度的尿液模型樣品,驗證了電信號內標法測量人體尿液代謝物的濃度的可行性,最后使用該方法測量真實的人體尿液中常見代謝物的濃度,測定結果與醫院常用生化分析儀器的測定結果相符。

【關鍵詞】 核磁共振; 電信號內標; 人體尿液; 定量分析

Abstract We report a complete assessment for urinary quantitative analysis by using an electronic signal as an internal reference, which was generated via decoupling channel on a Varian NMR spectrometer with its amplitude, frequency and transverse relaxation time digitally programmable according to a decoupling shape file. The electronic signal with excellent stability (standard deviation 0.4%) avoided possible problems such as insolubility, interaction and spectral overlap for a traditional internal reference. Concentration determination using the electronic signal proved to be reliable by a series of quantitative experiments. The relative error of quantification was about 1% and 5% when the analyte concentration was above 20 mmol/L and below 2 mmol/L respectively. We further measured the concentration of human urinary metabolites in a simultaneous fashion using this electronic internal reference and obtained consistent results with the values measured by the biochemical analysis instrument used in hospitals.

Keywords Nuclear magnetic resonance; Electronic internal reference; Human urine; Quantitative analysis

1 引 言

核磁共振(NMR)定量分析作為一種分析復雜樣品中化學成分含量的有效方法在有機化學[1,2],藥物控制[3],疾病診斷[4,5]和代謝組學[6~8]等研究領域有著廣泛的應用。NMR定量分析的顯著優點是經過一次實驗就可以獲得被測樣品中所有成分的含量,因此,NMR定量分析方法對于尿液,血清等包含數以百計代謝物的復雜樣品的濃度測量尤為重要[9~13]。NMR定量實驗通常需要一個參照標準,常見的參照標準是在樣品溶液中直接加入已知濃度的內標物,在NMR定量分析時,將樣品指定基團上質子的共振峰面積與內標物共振峰面積進行比較,通過內標物作為參照計算樣品的濃度。因此,所選的內標物必需溶于分析溶劑,與樣品中任何組分不能有相互作用,并且內標物與樣品共振峰不能重疊等。顯然,這些對內標物的要求限制了NMR作為一個通用定量分析方法進行使用。Akoka等[14~16]提出了NMR電信號內標法,通過測定樣品中H/D的比例檢測氘代試劑中氘百分含量,并把該方法應用到二維NMR和MRI的定量實驗中[17,18]。Ziarelli等[19~21]將電信號內標法應用于固體NMR實驗中進行定量分析。這些NMR電信號內標法定量實驗基本上都是在Bruker譜儀上進行的。最近,Mehr等[22]在Varian譜儀上使用一個定向耦合器把電信號耦合到NMR譜儀的接收通道實現了電信號內標法。 本研究在Varian譜儀上采用了電信號內標法,即通過去耦通道產生一個電信號,并由探頭13C線圈耦合到NMR譜儀的接收通道。通過實驗證明了此方法定量分析的可靠性,并選擇低濃度樣品(如尿液)進行了分析應用,為代謝組學和生化檢測等研究領域提供了一種通用可選的NMR定量分析的方法。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Varian INOVA 500MHz高分辨核磁共振波譜儀(美國Varian公司)。甘氨酸(Glycine)、二水合檸檬酸鈉(Trisodium citrate dihydrate)、葡萄糖(Glucose)、NaH2PO4·2H2O和K2HPO4·3H2O等(分析純,國藥集團化學試劑有限公司);丙氨酸(Alanine)和纈氨酸(Valine, 生化純,上海賀寶化工有限公司);D2O(99.9%)和TSP(3Trimethylsilyl[2,2,3,3D4] propionate)(美國Cambridge Isotope Laboratory公司)。

2.2 樣品制備

稱量10組甘氨酸(2.0~20.0 mg)和TSP(1.8~6.0 mg),分別溶于10根含0.5 mL D2O的5 mm核磁共振樣品管中(樣品濃度見表1),用于測量NMR電信號內標法定量分析的可靠性和誤差范圍。

稱量葡萄糖3.89 mg,丙氨酸1.85 mg,纈氨酸2.49 mg,二水合檸檬酸鈉5.93 mg和TSP 1.69 mg,以D2O配制的磷酸緩沖液(0.08 mol/L K2HPO4, 0.02 mol/L NaH2PO4, pH=7.4)溶解,并定容至10 mL(樣品濃度見表2)。該低濃度模型樣品,用來驗證NMR電信號內標法在定量分析中的可行性。

取糖尿病患者和正常人尿液各450 μL,50 μL磷酸鹽緩沖液(1.2 mol/L K2HPO40.3 mol/L NaH2PO4, 5.80 mol/L TSP, 0.03 mol/L NaN3, pH=7.4),溶于5 mm的核磁共振樣品管。稱量TSP 0.73 mg, 以D2O配制的磷酸鹽緩沖液(0.08 mol/L K2HPO4, 0.02 mol/L NaH2PO4, pH=7.4)溶解,并定容于2 mL容量瓶中,TSP濃度為2.12 mmol/L,用作尿液樣品濃度測定時電信號內標法的參照樣品。

2.3 NMR實驗

NMR實驗在Varian INOVA500譜儀上進行,1H共振頻率為500.13 MHz,Varian雙通道ID探頭,實驗溫度25 ℃。反轉恢復法[23]測定甘氨酸和TSP的T1值為3.4 和4.0 s。常規一維H譜實驗采用PRESAT預飽和壓水脈沖序列,脈寬為8.5 μs,預飽和壓水2 s,采樣點數64 k,譜寬8 kHz,弛豫延遲24 s,累加次數64。所有數據使用Bruker Topspin 2.0軟件處理,FID在Fourier變換前填零至128 k,用0.3 Hz指數增寬處理,進行手動相位校正和基線校正。

2.4 實驗方法

波形發生器(Waveform generator)[24,25]是Varian譜儀的基本組成部分,用于產生形狀脈沖進行選擇性激發。Varian譜儀的形狀文件中每一行定義了波形發生器中每一步信號輸出的幅度、相位和持續時間。Varian INOVA500譜儀波形發生器內存為64 k×32 bit,最大可允許64 k步的形狀文件。

若形狀文件定義每一步的幅度按指數衰減、相位線性增加,并持續時間相等,則波形發生器輸出電信號就會與FID同樣指數衰減,相位的線性變化會產生一定的頻率偏置,從而實現電信號在頻譜上位置的自由調整。該電信號由去耦通道產生,經過探頭的13C線圈在采樣期間發射,進入NMR譜儀的接收通路,從而在頻譜上獲得電信號內標的譜峰(圖1)。形狀文件定義的調制步數越多,每一步的持續時間越短,輸出的電信號就越理想。本研究使用的形狀文件調制步數為51200,能夠滿足實驗的要求。可以用式(1)描述波形發生器的輸出信號:A(t)=Ak·sin[ωIF·(t+kts)+φk]kts<t≤(k+1)ts, k=0,1,2,3,……,Ns -1(1)其中,k表示形狀調制文件的第k步,Ak是第k步的幅度,ωIF是波形發生器輸出的中頻頻率(20 MHz), ts為每一步調制的持續時間,φk是第k步的相位,Ns是形狀文件的步數。如果要在譜儀采樣期間產生類似FID的電信號,需要滿足如下條件:Ak=A0·e-kts/T2 φk=foffset·ktsAT=Ns·tsk=0,1,2,3,……,Ns-1(2)其中,A0是幅度調制的初值,可以認為是去耦通道的功率,T2是幅度指數衰減因子,一般要小于樣品的橫向弛豫時間。foffset是形狀文件每一步相位線性增加對應的等效頻率偏置,AT是采樣時間,波形發生器輸出電信號在采樣期間進入譜儀的接收通路。

3 結果與討論

3.1 電信號穩定性

電信號的穩定性直接影響電信號內標法進行定量測量的結果,在進行定量測量之前,要驗證該電信號的穩定性。通過關閉功率放大器,使得樣品的共振信號不在頻譜上出現,由于去耦通道的電信號仍然在采樣期間經過探頭的13C線圈耦合進入譜儀的接收通路,因此,頻譜上只有電信號內標的單峰,保持去耦通道功率(20 dB)和形狀文件不變,多次重復實驗,通過統計譜圖上單峰積分,測試該電信號的穩定性。實驗結果表明,該電信號幅度在-0.62%~0.60%范圍內波動,多次測量的標準偏差是0.36%(圖2)。電信號的波動源于譜儀電路部分的熱噪聲,波動幅度比較小則反映了譜儀去耦通道和波形發生器部分電路的穩定性。

3.2 NMR定量分析

NMR定量分析的原理是樣品內確定核(以1H核為例)的共振信號積分強度與樣品內該核的數量或者濃度成比例。如果已知濃度的參照樣品和未知濃度樣品在同等條件下進行NMR實驗,就可以通過參照樣品計算被測樣品的濃度,可以用式(3)表示:IACA·NA=IREFCREF·NREF(3)其中,CA和CREF表示待分析樣品和參照樣品的濃度,NA和NREF表示待分析樣品和參照樣品對應基團的質子數,IA和IREF表示待分析樣品和參照樣品對應基團譜峰的積分面積。 對10組包含不同濃度甘氨酸和TSP的樣品進行同樣條件下的NMR實驗,調整電信號內標的功率,使之與譜圖中其它共振峰的強度相當。甘氨酸,TSP和電信號內標都是單峰,易于積分。根據不同樣品的譜峰積分面積和質子濃度繪制曲線,可以發現積分面積與質子濃度呈較好的線性關系(圖3,甘氨酸,R2=0.9982; TSP, R2=0.9962)。 電信號內標在不同樣品中的積分近似水平直線,該直線與甘氨酸積分濃度直線的交點,即電信號內標所對應的等效質子濃度。通過一個參照樣品計算出電信號內標的等效質子濃度,就可以通過電信號內標確定其它未知樣品的濃度。 以第10個樣品作為參照樣品,分別以TSP和電信號作為內標,根據各樣品譜峰積分面積和公式(3)計算甘氨酸的濃度(見表1)。結果表明,電信號內標與TSP作為內標定量分析的差別不大,測量結果相對樣品配制濃度的偏差約為1%,因此,NMR電信號內標法可以取代傳統的內標物定量分析方法。 為了描述樣品的差異性,對每組樣品分別計算積分質子濃度的比例系數(Proportionality coefficient,PC),即積分濃度曲線斜率。對各組樣品的比例系數進行歸一化處理,計算相對誤差如下:PCA=IACA·NA REpc=PC-PCPC×100%(4)其中,PCA表示分析物A的積分質子濃度比例系數,REpc(Relative error)表示各組樣品中某分析物的比例系數的相對誤差。分別計算各組樣品中甘氨酸,TSP的相對誤差以及電信號積分的相對誤差,繪制相對誤差隨不同樣品的變化曲線(圖4)。表1 使用TSP和電信號內標測定甘氨酸的濃度(略)

結果表明,比例系數和電信號內標積分在不同樣品的實驗中存在4%的波動,可能是由于各組樣品中離子濃度不同,影響了探頭的調諧狀態或者品質因數,從而在同等條件下,電信號從探頭13C線圈耦合進入譜儀接收通路的程度不同造成的。但是可以看到各組樣品中甘氨酸與TSP的積分相對誤差和電信號積分相對誤差同步變化,即各組樣品計算的比例系數同步變化,盡管電信號內標在不同樣品中波動較大(4%),但是由于這種同步變化導致濃度測量誤差很小(約為1%,見表1)。

3.3 模型樣品濃度的測定

人體尿液中代謝物的濃度比較低,有的代謝物濃度已經接近NMR的檢測極限。為了驗證電信號內標法對低濃度樣品的測量誤差,配置濃度在1 mmol/L水平的模型樣品,主要包括葡萄糖,檸檬酸,丙氨酸,纈氨酸等常見代謝物,其中TSP溶于磷酸鹽緩沖液中,用以確定化學位移。本研究中,由于低濃度模型樣品和尿液樣品等都是用相同的磷酸鹽緩沖液配制的,樣品離子濃度變化不大,對測定結果的影響可以忽略。電信號內標放置在譜圖的左側,化學位移δ為7.6。通過已知濃度參照樣品得到電信號的等效質子濃度,然后測定模型樣品中常見尿液代謝物濃度,多次測量求平均值。表2中列出了用于代謝物定量分析的化學基團的化學位移和多重性,計算得到的濃度,標準偏差以及測量數值與樣品配置濃度的相對誤差。結果表明,電信號內標法測定濃度在1 mmol/L水平的樣品,誤差約為5%,其中丙氨酸的誤差較大(7.39%),明顯大于本研究3.2部分中20 mmol/L以上的樣品的測量結果;較小的標準偏差(<1.03%)說明測量結果具有好的重復性。對于低濃度樣品來說,這樣的測量誤差是可以接受的,因此,本方法能夠適用于濃度較低的尿液樣品的定量分析。表2 電信號內標法測定模型樣品的濃度(略)

3.4 人體尿液代謝物濃度的測定

分別對正常人和糖尿病患者尿液中代謝物濃度進行測定,樣品制備如2.2所述。圖5列出了人體尿液的一維1H譜和常見代謝物的譜峰歸屬,電信號經過調整放置在譜圖的最左側,化學位移δ(×106)為9.0。

表3列出了常見代謝物的濃度測定結果和測量的標準偏差。其中,參照樣濃度中TSP濃度(5.80 mmol/L)是樣品配制的濃度;肌酸酐(Creatinine)和葡萄糖(Glucose)的濃度是兩個尿液樣品在當地醫院進行的生化檢測的結果,檢測設備為美國貝克曼庫爾特有限公司的UniCel DxC 800 synchronron全自動生化分析系統。表3 電信號內標法測定人體尿液中代謝物的濃度(略) 實驗結果表明,兩個尿樣通過NMR電信號內標法分別測定的TSP濃度(5.95和5.53 mmol/L)與樣品配制的TSP濃度(5.80 mmol/L)相符合;測定的尿肌酐和葡萄糖的濃度與醫院生化檢測的結果也基本吻合。其中,正常人尿樣的葡萄糖測定結果(0.35 mmol/L)與醫院檢測結果(0.64 mmol/L)相差較大,主要因為尿樣中葡萄糖的含量較低,葡萄糖的共振峰信號強度已經接近噪聲水平,而且從峰形分析,葡萄糖的譜峰可能與附近的其它小信號重疊(見圖5b)。從總體上看,可以檢測濃度1 mmol/L的物質, 如甲酸鹽(Formate),葡萄糖(Glucose),馬尿酸鹽(Hippurate)等,定量檢測結果的標準偏差較大。雖然當濃度接近NMR檢測極限時,進行定量分析的誤差隨著濃度降低而增大,但是在本研究中NMR電信號內標法在人體尿液定量分析的誤差并不很大,測量結果具有很好的重復性和可靠性,可用于復雜樣品的定量分析。

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