作者：尚雁 李娜 覃小煥 魯保旺 傅強

【摘要】 利用吸附法將假絲酵母脂肪酶(candida rugosa lipase，CRL)固定在介孔分子篩SBA15上，對比了由單波長紫外分光光度法、雙波長紫外分光光度法和二辛可寧酸法(bicinchoninic acid method， BCA)法測定的酶蛋白濃度及酶蛋白固定量。結果表明: SBA15對紫外吸收有明顯干擾，單波長紫外法測定結果遠大于雙波長紫外法和BCA法，雙波長紫外法和BCA法測定結果較接近。利用BCA法測定了不同濃度CRL在介孔分子篩上的固定量，考察了固定化酶的泄漏量。在編號分別為Lu001和LLSD1的介孔分子篩SBA15上的載酶量分別為16.6和114.12 mg/g。在緩沖溶液中SBA15固定化酶的泄漏率只約為0.5%，可作為良好的酶固定化載體。

【關鍵詞】 介孔分子篩SBA15，脂肪酶，酶蛋白固定量，紫外分光光度法，二辛可寧酸法

1 引 言

介孔材料孔徑介于微孔與大孔之間，具有大的表面積和多維孔道結構，介孔硅基分子篩SBA15具有高度有序的六邊形直孔結構，孔徑在5～50 nm范圍，對酶分子具有較強吸附能力，是固定化酶的新材料[1]。將酶固定于介孔分子篩上有利于保持酶活穩定性，便于酶的重復利用。高的酶固定量和低的酶泄露量是固定化效果的重要指標。介孔分子篩載體的酶固定量測定方法有紫外分光光度法[2，3]、BCA(bicinchoninic acid method)法[4]、Bradford法[5，6]、凱氏定氮法[7]及Lowry法[8]等。針對不同分析方法的酶固定量測定結果差異以及介孔分子篩干擾未見報道，無法判斷不同分析方法所測結果的可比性。為此，本研究分別采用常見的單波長紫外分光光度法、雙波長紫外分光光度法和BCA法考察了CRL在介孔分子篩SBA15上的固定量和介孔分子篩對紫外吸收的影響，分析了不同SBA15的固定量差異，考察了固定化酶的泄露量，為將介孔分子篩固定化脂肪酶用于催化反應的后續研究奠定了基礎。

2 實驗部分

2.1 材料與儀器

TG16高速離心機(19310 g，長沙英泰儀器有限公司);UV2000紫外可見分光光度計(尤尼柯上海儀器廠); vertex 70型紅外光譜儀(德國Bruker公司);AM3250B型磁力攪拌恒溫器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)。

介孔分子篩SBA15的合成利用表面活性劑Pouronic P123(EO20PO70EO20， 美國Aldrich公司)為模板劑，以濃HCl( 35%～37%)為催化劑，通過對正硅酸乙酯(Si(OC2H5)4， TEOS， 95.0%，日本Junsei Chemical公司)的分解和硅縮聚反應后而得到。編號Lu001和LLSD1的介孔分子篩合成方法基本相同，原料量略有不同，二者的BET比表面積762 m2/g，孔容0.87 cm3/g，孔徑7.18 nm，壁厚3.55 nm。柱狀假絲酵母脂肪酶(candida rogusa lipase， CRL)購自日本Amano酶技術公司;BCA蛋白定量試劑盒購自美國Pierce公司。實驗用水為二次蒸餾水。

2.2 傅立葉變換紅外(FTIR)測試

樣品和KBr在115 ℃下抽真空烘干10 h。將300 mg KBr和2.2 mg樣品在研缽中混合研磨成細粉后壓片，干燥后立刻置于紅外光譜儀的石英原位池中測試。儀器分辨率為2 cm-1，掃描波數范圍4000～400 cm-1，掃描128次。

2.3 CRL在SBA15上的固定化

將CRL磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)以3000 r/min離心15 min，收集上清液，得原酶溶液。將適量SBA15放入原酶溶液中，在15 ℃水浴和150～200 r/min下攪拌吸附21 h，再以10000 r/min下離心15 min，收集上清液為吸余液。用磷酸鹽緩沖溶液清洗分子篩4次以洗脫疏松附著的酶，洗脫液再以10000 r/min離心15 min，取出上清液為清洗液。測定原酶溶液、吸余液和清洗液的酶蛋白含量，根據物料衡計算得出酶蛋白固定量(immobilized amount of enzyme protein， mg)，取單位質量分子篩的酶蛋白固定量為載酶量(enzyme loading， mg/g)。

2.4 固定化CRL的泄漏

將上述載酶SBA15移入70 mL磷酸鹽緩沖溶液中，在15 ℃水浴、以150～200 r/min攪拌并定時取樣，樣品再以10000 r/min離心15 min，分析上清液中的酶蛋白泄漏量。

2.5 蛋白質定量方法

分別用單波長紫外分光光度法、雙波長紫外分光光度法和BCA法測定樣品蛋白質含量。單波長紫外法公式為：C(protein)(g/L) =F×A280×D/d，式中A280為280 nm波長處吸光度，D為溶液稀釋倍數，d為石英比色皿厚度(cm)，F為校正因子。雙波長紫外法WarburgChristian公式為：C(protein)(g/L)=1.55A280-0.76A260; LowryKalckar公式為：C(protein)(g/L)=1.45A280-0.74A260，式中A260和A280分別為260 和280 nm紫外波長下的吸光度。BCA法參照美國Pierce公司蛋白定量方法測定。 分 析 化 學第37卷第8期尚 雁等：介孔分子篩SBA15的脂肪酶固定量分析測定

3 結果與討論

3.1 蛋白質定量方法對比

圖1表明不同濃度CRL溶液在260～280 nm均有一個較強的吸收峰，該吸收峰為蛋白質芳香族氨基酸的特征峰，用于蛋白質含量測定。將粗酶濃度為6 g/L的CRL溶液進行不同倍數稀釋，得到一系列相對濃度已知的酶溶液，分別用單波長和雙波長紫外法以及BCA法測定酶濃度，驗證所測濃度比例關系是否符合其相對濃度，由此得出各檢測方法的準確度。圖2結果說明BCA法測定結果與樣品稀釋后的相對濃度最接近，雙波長紫外法測定值與BCA法接近，單波長法測定結果遠高于BCA法和雙波長紫外法。由表1中的相對濃度計算結果可知，BCA法的相對誤差最小，單波長和雙波長紫外法的相對誤差較大。這是因為BCA法的原理是以工作試劑CuSO4中的Cu2+螯合蛋白質分子，發生顯色反應測試吸光度，因此抗干擾能力較強，準確度較高。紫外分光光度法操作步驟少，簡單快捷，不用顯色試劑，不消耗樣品。但是，直接檢測光密度值受溶液中雜質干擾影響較大，誤差較大。

為考察介孔分子篩對吸光度的影響，分別在3 mL蒸餾水中加入0.1， 0.6和0.9 mg SBA15(編號Lu001)，以蒸餾水為參比樣，測定其吸光度，并計算出可能對蛋白質測定產生的濃度值偏差。表2說明SBA15有明顯紫外吸收。為此，本實驗的樣品溶液以10000 r/min離心，以消除介孔分子篩對吸光度的干擾。表1 不同方法測定蛋白質濃度的結果表2 SBA15對吸光度的影響 表3為不同定量方法測定的 SBA15(編號為Lu001)對CRL的固定量，3次平行實驗的初始粗酶濃度均為6 g/L，SBA15載體用量均為0.36 g，雙波長紫外法測定結果略高于BCA法; 單波長紫外法測定結果遠高于雙波長法和BCA法。表3還說明BCA法的精密度高于單波長與雙波長紫外法，這是因為BCA法靠顯色反應測試吸光度，靈敏度較高，且介孔分子篩不參與顯色反應，抗干擾能力較強，重現性好，更適合介孔分子篩載體的酶固定量和酶泄露量的測試;紫外分光光度法受溶液中雜質和殘留介孔分表3 SBA15上的CRL固定量及載酶量

◆: 固定量(amount of immobilized protein); ◇: 載酶量(enzyme loading).子篩干擾較大。由于雙波長紫外法測定的酶固定量結果與BCA法較接近，若實驗條件有限或者為了不消耗樣品且干擾因素較少，可使用雙波長紫外法來代替BCA法測定酶固定量，每個樣品中的介孔分子篩干擾可通過物料衡算而抵消。

3.2 不同初始酶濃度時BSA15載體上的酶固定量

利用BCA法測定不同初始酶濃度條件下LLSD1對CRL的固定量，圖3表明當酶濃度較低時，SBA15載體對CRL的固定量和載酶量隨酶濃度的增加而線性增加，但是當酶蛋白濃度達到約0.29 g/L(粗酶濃度約1 g/L)時固定量和載酶量達到平穩，最大載酶量為114.2 mg/g。

3.3 兩種SBA15載體的酶固定量

在初始酶濃度均為2 g/L、分子篩用量均為0.12 g相同條件下，LLSD1和Lu001對CRL的固定圖4 LLSD1(a)和Lu001(b)的SEM電鏡照片

Fig.4 SEM images of LLSD1(a) and Lu001(b)量分別為13.70和2.00 mg;載酶量分別為114.2和16.6 mg/g。可見，LLSD1的固定量及載酶量遠大于Lu001。圖4為LLSD1和Lu001的SEM電鏡照片，可見二者外觀形狀基本相同，均屬于SBA15的傳統形狀[9]，二者大小也無明顯區別。圖5是LLSD1和Lu001的FTIR譜圖，從圖中可看出LLSD1表面上的羥基基團數量大于Lu001。由于酶的吸附是酶和介孔材料表面上的羥基通過氫鍵作用完成的，介孔分子篩表面上的羥基通過氫鍵作用可以促進對酶的吸附[10]。因此， 圖5 Lu001(1)和LLSD1(2)的FTIR譜圖

Fig.5 FTIR spectra of Lu001(1) and LLSD1(2)兩種介孔分子篩對酶固定量差異很可能與介孔分子篩的羥基含量有關，具有較高羥基含量有利于固定更多的CRL。

3.4 SBA15固定化酶的泄漏量

固定化酶容易“脫落”到水相中成為游離酶，即“泄漏”[11]。圖6表明Lu001固定化CRL在緩沖溶液中100 h后的泄漏率為0.56%，LLSD1的泄漏率為0.53%，泄露量均較低，說明SBA15是良好的酶固定化載體。泄露率較低可能與SBA15孔徑大小有關。研究[3，12]表明， 當介孔材料的孔徑與酶分子大小相適應時，固定化酶的穩定性較好。Lu001和LLSD1的孔徑均為7.18 nm，假絲酵母脂肪酶的動力學直徑約為5 nm，二者大小較匹配，使酶分子恰好固定于孔內而不易發生泄露。

◆，■，▲，● 為泄露量(leakage); ◇，口，△，○為泄露率(leakage rate)，其中◆， ◇ ： 0.12 g LLSD1， 載酶量(enzyme loading) 114.2 mg/g; ■，口： 0.24 g LLSD1， 載酶量(enzyme loading) 111.3 mg/g;▲， △： 0.36 g Lu001， 載酶量(enzyme loading) 14.2 mg/g;●，○： 0.36 g Lu001， 載酶量(enzyme loading) 16.6 mg/g。