【摘要】 目的 觀察Calbindin-D28k在小鼠腎發生發育中的表達規律。方法 應用蛋白印跡技術對各組小鼠腎Calbindin-D28k的表達進行定量檢測。結果 胚齡12 d Calbindin-D28k表達量極低；胚齡14 d到胚齡16 d表達量增加；胚齡16 d到胚齡18 d表達量無顯著性變化；胚齡18 d到生后7 d表達量明顯增加；生后7 d到生后14 d，Calbindin-D28k表達量減少。生后14 d到生后40 d，Calbindin-D28k表達量無顯著性差異。結論 從胚齡12 d到生后7 d期間Calbindin-D28k表達的逐漸增強與小鼠腎鈣離子轉運能力的完善可能有一定的關系。

【關鍵詞】 Calbindin-D28k 小鼠 腎發育

Abstract：Objective To observe the expression rules of Calbindin-D28k during renal development of mouse. Methods Western blotting technique was used to measure the protein content of Calbindin-D28k at different development stages of embryonic and postnatal mice. Results At E12， Calbindin-D28k expression could be hardly detected in the kidney. From E14 to E16， the expression was increased. There was no significant difference from E16 to E18. From E18 to N7， the expression of Calbindin-D28k was increased obviously. From N7 to N14， the expression of Calbindin-D28k was decreased. There was no significant difference between N14 and 40. Conclusions The expression of Calbindin-D28k is weak at E12， and is enhanced with ages to the peak at N7， and decreased thereafter. Calbindin-D28k is a calcium ferry protein in cytoplasm and is very important to renal calcium reabsorption during the development of kidney.

Key words：Calbindin-D28k; mouse; renal development

Calbindin-D28k最初是由Wasserman和Taylor［1］于1966年在雞小腸粘膜中發現的，其分子量約為27.8×103，由于在小腸中的合成受1，25-二羥基維生素D3水平的調節，故又被稱為維生素D依賴性鈣結合蛋白（Vitamin D-dependent calcium binding protein，CaBP）［2］。Calbindin-D28k與腎發育關系的研究國外曾見報道［3，4］，但關于小鼠腎發育中Calbindin-D28k表達的定量研究國內尚未見報道。本實驗通過蛋白印跡（Western blotting）技術定量檢測小鼠腎發育過程中Calbindin-D28k的表達規律，探討其與小鼠腎發育之間的關系。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

25～30 g 成年健康昆明小白鼠，由遼寧醫學院實驗動物中心提供［醫動字第 SCXY(遼)2003-2007號］。

1.2 實驗試劑

Calbindin-D28k單克隆抗體由武漢博士德生物工程有限公司提供;PVDF膜、SDS、NBT/BCIP、Tween-20、NP-40、PMSF等由SIGMA公司提供。

1.3 標本制備

選用成年健康昆明小白鼠，按雌雄比例1∶1同窩飼養，以陰道栓脫落的最早時間計為胚齡（E）0 d［5］。孕鼠分籠飼養，每日早8∶00、晚5∶00觀察生產情況，以仔鼠出生的最早時間計為生后（N）0 d。分別取E10、12、14、16、18 d胎鼠和N1、3、7、14、21、40 d仔鼠，每組8只，每只母鼠取2只胎鼠或仔鼠。

1.4 Western blotting定量檢測Calbindin-D28k

各組小鼠取右腎，入液氮迅速冷凍，-85 ℃冰箱保存待用。取冷凍待用的右腎組織，置于1～2 mL勻漿器中，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎，加入4倍體積的裂解液(50 mM Tris-HCl，，pH 8.0 150 mM NaCl，100 μg/mL PMSF，1% TritonX-100) 0 ℃下勻漿、冰上裂解30 min，冷凍離心機(12 000 r/min) 4 ℃，20 min離心去除細胞碎片，取上清液，用考馬斯亮蘭法測定總蛋白含量。每個樣品取25 μg與5×十二烷基硫酸鈉（SDS）上樣緩沖液混合，煮沸5 min，100 g/L十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉硝酸纖維素膜。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗-Calbindin-D28k單克隆抗體(稀釋度為1∶400)，二抗-生物素化山羊抗小鼠IgG（稀釋度為1∶700 )， NBT/BCIP試劑顯色，掃描電泳條帶 ，用Gene Tools軟件分析電泳條帶凈吸光度值。

1.5 統計學分析

應用SPSS 12.0統計軟件包對實驗數據進行統計學分析，數據以±s表示，采用單因素方差分析檢驗，P＜0.05認為有統計學意義。

2 結果

各胚（日）齡小鼠腎Calbindin-D28k表達量電泳結果見圖1，凈吸光度值見表1、圖2。胚齡12 d，Calbindin-D28k表達量極低，無法檢測。胚齡14 d到胚齡16 d，Calbindin-D28k表達量增加，差異有顯著性意義［（12.0994±0.6911），（13.2383±0.1729），P<0.01］。 胚齡16 d到胚齡18 d，Calbindin-D28k表達量無明顯變化(P＞0.05)。胚齡18 d到生后7 d，Calbindin-D28k表達量明顯增加，差異有顯著性意義［（13.8447±0.2385），（15.2718±0.2019），（16.3208±0.2839），（19.3383±0.4044），P<0.01］。生后7 d到生后14 d，Calbindin-D28k表達量減少，差異有顯著性意義［（19.3383±0.4044），（15.8915±1.0185），P<0.01］。生后14 d到生后40 d，Calbindin-D28k表達量無顯著變化(P＞0.05)。表1 各胚（日）齡小鼠腎Calbindin-D28k表達量（略）注：aP＜0.01，與前一胚（日）齡比較有顯示性差異

3 討 論

Calbindin-D28k是一種細胞內與鈣高親和力蛋白，存在于與鈣轉運密切相關的組織中。從系統發育的角度看，Calbindin-D28k是一個古老的大分子，在進化早期，它僅是一個神經蛋白，隨著向更高的種族發育，它才被存留于其他組織中，如腎臟、腸道和胎盤［6］。在腎臟，Calbindin-D28k定位于遠端腎單位的遠曲小管、連接小管、皮質集合管［7］。

在前期研究中，我們應用免疫組織化學技術結合圖象分析方法發現Calbindin-D28k在胚齡12 d小鼠胎鼠輸尿管芽上皮細胞胞漿內可見微弱的表達。胚齡16 d Calbindin-D28k在輸尿管芽壺腹可被明顯的觀察到，并且隨著腎單位發育即S小體的出現，在S小體與輸尿管芽壺腹之間的連接小管也出現微弱表達。隨著腎發育，Calbindin-D28k的表達逐漸增強，最終定位于小鼠腎遠曲小管、連接小管和皮質集合管。本實驗進一步采用蛋白印跡技術對Calbindin-D28k表達進行定量分析，發現 Calbindin-D28k從胚齡12 d的胎鼠開始表達到生后7 d的小鼠其表達量逐漸增加，而從生后7 d到生后40 d的小鼠，陽性表達稍減少并趨于平穩，沒有顯著性的變化。推測從胚齡12 d到生后7 d期間Calbindin-D28k表達的逐漸增強與小鼠腎鈣離子轉運能力的完善有一定的關系。關于Calbindin-D28k的生理功能，學者們提出了幾種理論：載體學說認為Calbindin-D28k作為一種運輸蛋白，可與鈣離子結合并參與細胞內鈣的轉運過程。緩沖理論認為Calbindin-D28k可能是細胞內鈣緩沖劑，通過與鈣離子結合來保持細胞內鈣的平衡，防止達到中毒劑量，以保持組織細胞的正常發育。活化劑理論認為Calbindin-D28k增加了管壁膜鈣通道的活性，或Ca2+-Mg2+-ATP酶的活力 ，因而增加了鈣的重吸收［8］。總之，對Calbindin-D28k在腎表達的相關研究，將有助于增進對腎發生發育的認識，有利于闡明Calbindin-D28k在腎鈣轉運中的作用，從而為臨床腎鈣平衡失調的研究提供基本的實驗數據。