作者：陳波曼 余加林 劉官信 胡琳燕 李芳 楊華

【摘要】 目的 探討銅綠假單胞菌細(xì)菌生物膜(biofilm，BF)形成發(fā)展過(guò)程中空間立體結(jié)構(gòu)變化，以及BF形成過(guò)程中與其生物學(xué)行為之間的相互聯(lián)系。方法 體外建立6h和1、3及6d等4個(gè)時(shí)間組銅綠假單胞菌PAO1菌株BF模型，通過(guò)綠色熒光蛋白(green fluorescence protein，GFP)標(biāo)記，結(jié)合激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscopy，CLSM)攝取BF形成發(fā)展各階段不同層面的圖片堆，經(jīng)圖像結(jié)構(gòu)分析軟件(image structure analyer，ISA)分析獲得PAO1菌株BF相關(guān)空間結(jié)構(gòu)參數(shù)定量化數(shù)據(jù)。結(jié)果 ①CLSM結(jié)合GFP標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)了對(duì)PAO1菌株BF動(dòng)態(tài)形成過(guò)程的觀察；②ISA軟件定量化分析顯示，隨著B(niǎo)F發(fā)展，厚度不斷增加，前3d增加程度(19.6μm)明顯大于后3d(6.1μm)，區(qū)域孔率(areal porosity，AP)、平均擴(kuò)散距離(average diffusion distance，ADD)和結(jié)構(gòu)熵(textural entropy，TE)在BF形成的6h和6d分別為：0.98±0.01和0.92±0.02，呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；1.00±0.009和1.06±0.027，雖變化幅度不大，但亦呈現(xiàn)逐漸增加趨勢(shì)；0.7±0.08和4.3±0.09，呈明顯上升趨勢(shì)。結(jié)論 ISA程序可以表征PAO1菌株BF的空間結(jié)構(gòu)特征，對(duì)細(xì)菌BF結(jié)構(gòu)的定量化分析也有助于探索BF形成過(guò)程與其生物學(xué)行為之間的相互聯(lián)系。

【關(guān)鍵詞】 生物膜； 銅綠假單胞菌； 定量分析； 結(jié)構(gòu)

ABSTRACT Objective To quantify the sequential development of biofilm spatial structure in biofilm process with Image Structure Analyer (ISA) software， which will provide assistant to further research on the biological behavior of biofilm. Methods P.aeruginosa PAO1 biofilm model in vitro was constructed on glass slice and biofilm development was monitored in different time intervals (6 hours， 1 day， 3 days and 6 days). The fluorescence images stack of different layer in biofilm model were obtained by confocal laser scanning microscopy (CLSM)， based on fluorophores from PAO1 with green fluorescent protein (GFP) genetically tagged. Quantitative parameters describing biofilm spatial structure could be acquired after the image information was calculated by ISA software. Results ①The PAO1 biofilm process was investigated successfully by CLSM after genetically tagged with GFP. ②The quantitative data from ISA software showed that the thickness of biofilm accumulated during biofilm growth， the rate was more obvious during the first 3 days than the latter 3 days (19.6μm vs. 6.1μm); meanwhile the areal porosity (AP) decreased from 0.98±0.01 at 6h to 0.92±0.02 at 6d， the average diffusion distance (ADD) increased slightly from 1.00±0.009 at 6h to 1.06±0.027 at 6d; the textural entropy (TE) increased from 0.7±0.08 at 6h to 4.3±0.09 at 6d. Conclusions The ISA software could provide useful information of bacterial biofilm spatial structure in PAO1 biofilm process. Quantifying bacterial biofilm structure permitsed correlating biofilm development with biofilm performance.

KEY WORDS Biofilm; Pseudomonas aeruginosa; Quantitative analysis; Structure

長(zhǎng)久以來(lái)，人們對(duì)細(xì)菌的認(rèn)識(shí)停留在浮游態(tài)水平上，但自然界中99%的細(xì)菌以生物膜(biofilm，BF)的形式存在。細(xì)菌BF是細(xì)菌為適應(yīng)生存環(huán)境黏附惰性或活性材料表面形成的一種與浮游細(xì)胞相對(duì)應(yīng)的生長(zhǎng)方式，具有環(huán)境適應(yīng)能力更強(qiáng)，抵抗吞噬細(xì)胞作用，逃避宿主免疫，尤其耐藥性極強(qiáng)等生物學(xué)特性，而B(niǎo)F的許多特性均與其特殊形態(tài)結(jié)構(gòu)有關(guān)。銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，Pa)是我國(guó)醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染及重癥監(jiān)護(hù)病房感染的重要條件致病菌，近年來(lái)研究證明，該菌極易形成BF［1］，臨床上，有BF表型的Pa往往引起難以治愈的嚴(yán)重感染。以往研究多采用光鏡、掃描或透射電鏡等觀察細(xì)菌BF結(jié)構(gòu)，但樣本在脫水、固定、染色等處理過(guò)程中易發(fā)生結(jié)構(gòu)扭曲及關(guān)系改變。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立體外PaO1菌株BF模型，結(jié)合綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記技術(shù)，運(yùn)用激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscopy，CLSM)攝取BF發(fā)展成熟各階段不同層面的圖像，所獲圖片堆經(jīng)圖象結(jié)構(gòu)分析(image structure analyer，ISA)軟件分析，獲得PAO1菌株BF發(fā)展過(guò)程相關(guān)空間結(jié)構(gòu)變化的數(shù)據(jù)，以期實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌BF的無(wú)損傷觀察，并對(duì)BF空間結(jié)構(gòu)的定量化分析進(jìn)行了初步探索。

1 材料和方法

1.1 試劑和菌株

銅綠假單胞菌PAO1菌株(本實(shí)驗(yàn)室保存)，pGFPuv質(zhì)粒(Clontech公司)，質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒(日本BioFlux公司)，限制型內(nèi)切酶EcoRI和HindIII(寶生物公司)，ISA軟件(美國(guó)Montana州立大學(xué)Haluk Beyenal教授提供)。

(1)PAO1菌株電感受態(tài)制備 參考單志英等［2］實(shí)驗(yàn)方法，將過(guò)夜增菌的PAO1菌株轉(zhuǎn)接于50ml SOB培養(yǎng)基中，37℃，200r/min振蕩培養(yǎng)；A600值為0.7左右時(shí)中止培養(yǎng)；2℃，6000r/min離心15min；菌體沉淀依次用等體積、1/2體積、1/5體積的0.3mol/L冰浴蔗糖溶液重新懸浮，洗滌菌體；2℃，6000r/min離心15min，最后根據(jù)菌體多少加入不同體積的0.3mol/L蔗糖溶液將菌體混勻；分裝成每管100μl，直接用于電轉(zhuǎn)化。

(2)pGFPuv質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化菌株篩選 感受態(tài)細(xì)胞100μl，質(zhì)粒約50ng，加入預(yù)冷的0.1cm電轉(zhuǎn)化杯中；在BioRad電轉(zhuǎn)化儀上(設(shè)置電壓1.5kv，電容25μF，電阻200Ω)進(jìn)行電擊5ms；將轉(zhuǎn)化體系加入37℃溫浴的800μl SOC培養(yǎng)基中，37℃，100r/min振蕩復(fù)蘇1h；取100μl菌液涂布篩選培養(yǎng)基，37℃，16h～18h；在篩選培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，且紫外燈下有綠色熒光的菌落即為實(shí)驗(yàn)需要的轉(zhuǎn)化菌株。

(3)轉(zhuǎn)化菌株中質(zhì)粒提取和酶切電泳鑒定 挑取表達(dá)強(qiáng)綠色熒光的轉(zhuǎn)化菌株單菌落，接種LBroth培養(yǎng)液，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；按照BioFlux公司質(zhì)粒提取試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明進(jìn)行質(zhì)粒的小量提取；0.8%瓊脂糖凝膠電泳；對(duì)照pGFPuv質(zhì)粒圖譜進(jìn)行鑒定。用EcoRI和HindIII行雙酶切，反應(yīng)溫度為37℃；反應(yīng)體系為HindIII 1μl，EcoRI 1μl，10×M緩沖液2μl，提取質(zhì)粒17μl，作用12h；0.8%瓊脂糖凝膠電泳。

(4)pGFPuv轉(zhuǎn)化菌株建立BF模型 挑取GFP轉(zhuǎn)化PAO1菌株單菌落接種LBroth培養(yǎng)液，37℃，180r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；調(diào)整A600值至0.5；接種PAO1菌液于預(yù)先放置滅菌蓋玻片(8mm×8mm，作為黏附載體)的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔1ml；37℃，分4個(gè)不同時(shí)間段6h、1d、3d、6d孵育，隔日換液，每個(gè)時(shí)間段重復(fù)5次。

1.2 激光共聚焦顯微鏡觀察

氬激光(488nm)激發(fā)，物鏡×20，每個(gè)模型由外(BF游離的一面)向內(nèi)(BF和玻片相貼的一面)逐層掃描(沿Z軸掃描)，每個(gè)標(biāo)本掃描8～16張。

1.3 運(yùn)用ISA軟件對(duì)PAO1菌株BF結(jié)構(gòu)定量化分析

將上述獲得的各時(shí)間組模型圖片堆調(diào)入ISA3D軟件，確認(rèn)圖片的完整性及順序后運(yùn)行ISA及ISA3D命令，運(yùn)行結(jié)果包括：①結(jié)構(gòu)參數(shù)：如結(jié)構(gòu)熵(textural entropy，TE)、結(jié)構(gòu)能(energy，E)、均一性(homogeneity，H)；②平面參數(shù)：區(qū)域孔率(areal porosity，AP)、平均擴(kuò)散距離(average diffusion distance，ADD)、最大擴(kuò)散距離(maximum diffusion distance，MDD)等指標(biāo)；③其它參數(shù)：如生物量(biovolume，BV)、比表面積(surface area between biomass and void，SA)、單位面積生物膜體積(biomass volume to surface area ratio，V2SA)等［3］。輸出數(shù)據(jù)以EXCEL格式保存。

2 結(jié)果

2.1 GFP標(biāo)記的PAO1菌株構(gòu)建與發(fā)光表型觀察

通過(guò)電轉(zhuǎn)化方法對(duì)PAO1菌株進(jìn)行了pGFPuv標(biāo)記。轉(zhuǎn)化菌株自然光下即可見(jiàn)綠色熒光，在紫外燈下發(fā)出強(qiáng)綠色熒光；熒光顯微鏡下，轉(zhuǎn)化菌株菌體發(fā)出明亮的綠色熒光，細(xì)菌形態(tài)呈短棒狀，提示pGFPuv已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入了PAO1菌株中，該轉(zhuǎn)化菌株可以作為BF空間結(jié)構(gòu)定量化分析研究的模式菌。

2.2 轉(zhuǎn)化菌株質(zhì)粒提取鑒定及雙酶切鑒定

轉(zhuǎn)化菌株抽提質(zhì)粒后，電泳結(jié)果顯示在2000和3500bp之間有一條約3300bp帶，條帶與質(zhì)粒大小吻合。提取的質(zhì)粒進(jìn)行EcoRI和HindIII雙酶切，電泳顯示在2000和3500bp之間有一條約2500bp帶，在500和1000bp之間有一條約800bp帶，與預(yù)期結(jié)果吻合，提示pGFPuv已成功轉(zhuǎn)入PAO1菌株，并以游離質(zhì)粒形式表達(dá)。

2.3 CLSM觀察GFP標(biāo)記BF模型

6h左右，PAO1已經(jīng)在玻片上黏附聚集，發(fā)出綠色熒光；1d組模型多為綠色熒光，細(xì)菌呈微菌落聚集，已具有一定厚度；隨著時(shí)間延長(zhǎng)，BF變厚，3d組及6d組模型肉眼可見(jiàn)一層灰白色膜狀物平鋪于玻片上，鏡下可見(jiàn)大片狀BF，細(xì)菌密集，層疊如積云狀，棉絮樣，具備復(fù)雜空間結(jié)構(gòu)，細(xì)菌之間有許多非綠色的黑色區(qū)域，呈管道或泡狀。

2.4 ISA軟件結(jié)構(gòu)定量化分析

對(duì)各時(shí)間組模型的平均厚度、AP、ADD及TE進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，各時(shí)間組PAO1菌株BF的平均厚度不斷增加，增加程度在前3d比較明顯，每個(gè)時(shí)間組之間增加10μm以上，3d后增加速度減慢，3d組與6d組BF的平均厚度僅增加了6μm(表1)；隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，各時(shí)間組模型的AP值呈下降趨勢(shì)，由最初的0.98下降到0.92；TE值由最初的0.7上升到4.3，增幅接近6倍；ADD值雖然變化幅度不大，但是呈上升趨勢(shì)(表1)。表1 各時(shí)間組PAO1菌株BF的平均厚度、AP、ADD及TE值

3 討論

細(xì)菌BF是一個(gè)三維立體空間結(jié)構(gòu)的生態(tài)系，是一個(gè)具有高度結(jié)構(gòu)性、協(xié)調(diào)性和功能性的組織群體，BF結(jié)構(gòu)的維持對(duì)BF生物學(xué)行為具有重要意義。深入認(rèn)識(shí)BF的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，不能停留在某一平面的形態(tài)描述，還需要對(duì)BF的空間結(jié)構(gòu)展開(kāi)定量化分析。由于報(bào)道基因中常用的綠色熒光蛋白(GFP)的基因具有基因小、性質(zhì)穩(wěn)定、對(duì)細(xì)胞安全等優(yōu)點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用電轉(zhuǎn)化方法，成功地將pGFPuv轉(zhuǎn)入PAO1中，建立體外PAO1菌株BF模型，運(yùn)用CLSM觀察以保證細(xì)菌BF結(jié)構(gòu)的完整性，連續(xù)檢測(cè)其在玻片表面定植形成BF的過(guò)程，結(jié)合計(jì)算機(jī)圖像處理分析系統(tǒng)，對(duì)BF結(jié)構(gòu)進(jìn)行定量化分析。

BF形成發(fā)展是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，生長(zhǎng)周期一般分為5個(gè)階段：最初的定植階段、不可逆黏附階段、結(jié)構(gòu)分化階段、發(fā)展成熟階段和解聚再定植階段［4］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)CLSM連續(xù)動(dòng)態(tài)觀察PAO1菌株BF形成，基本反映了這樣一個(gè)過(guò)程：6h左右PAO1菌株開(kāi)始在玻片表面黏附聚集，1d左右初步形成BF，3d時(shí)BF基本形成，具備三維結(jié)構(gòu)，此后BF逐漸發(fā)展達(dá)到一個(gè)平衡，這與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致［5］。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，BF厚度逐漸增加，但趨勢(shì)漸緩，可能與BF營(yíng)養(yǎng)滲透屏障有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)還采用ISA軟件獲得了BF空間結(jié)構(gòu)參數(shù)的定量化數(shù)據(jù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)BF基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)特征的定量化分析。該軟件由美國(guó)Montana州立大學(xué)的生物膜工程中心2000年開(kāi)發(fā)，采用自動(dòng)定閾系統(tǒng)［6］，降低了圖片處理中主觀因素的影響，對(duì)BF的二維和三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行更多參數(shù)的測(cè)定和比較。

ISA提供厚度參數(shù)顯示，GFP標(biāo)記的BF模型平均厚度在前3d內(nèi)增長(zhǎng)速度明顯快于后3d，提示BF生長(zhǎng)速度的不均一性。細(xì)菌黏附后初期，BF迅速增厚，但隨著時(shí)間延長(zhǎng)，BF厚度增加趨勢(shì)減慢，其原因除與營(yíng)養(yǎng)限制有關(guān)外，也可能是BF增加到一定厚度后，為保證底層細(xì)菌獲得一定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而維持自身結(jié)構(gòu)，對(duì)自身發(fā)出密度感應(yīng)(quorum sensing，QS)信號(hào)產(chǎn)生反應(yīng)，達(dá)到平衡狀態(tài)。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)BF的觀察中還發(fā)現(xiàn)BF并非一層單純的致密膜，其內(nèi)部存在很多黑色相互交通的間隙及孔道，Stoodley等［7］認(rèn)為這些大、小不一的間隙和通道是BF結(jié)構(gòu)的重要組成部分，其中充滿了胞外多糖和蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，與深層BF中的細(xì)菌生長(zhǎng)關(guān)系密切。Wood等［8］在牙菌斑BF也發(fā)現(xiàn)類似的間隙和通道貫穿于整個(gè)BF之中，其功能類似初級(jí)循環(huán)系統(tǒng)，活菌緊緊圍繞在這些孔和通道的周圍，保證營(yíng)養(yǎng)的獲取和排除代謝廢物。此外，BF還可以借這些通道來(lái)感知QS信號(hào)。BF這種結(jié)構(gòu)特點(diǎn)決定BF具有一個(gè)能適應(yīng)多種理化變化的內(nèi)環(huán)境。

ISA軟件通過(guò)區(qū)域孔率(AP)和平均擴(kuò)散距離(ADD)這兩個(gè)參數(shù)，客觀反映BF結(jié)構(gòu)發(fā)展過(guò)程中間隙孔道及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)距離變化。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，BF厚度逐漸增加，AP逐漸減低，ADD逐漸增加，提示BF逐漸發(fā)展，細(xì)菌聚集越來(lái)越致密，BF結(jié)構(gòu)中間隙及通道的孔徑和數(shù)目減少，相應(yīng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)距離增加，細(xì)菌物質(zhì)代謝受到一定限制而將逐漸發(fā)展達(dá)到一個(gè)相對(duì)穩(wěn)態(tài)。

BF不僅在結(jié)構(gòu)上存在多樣、開(kāi)放、不均一性特點(diǎn)，而且環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、代謝產(chǎn)物、信號(hào)分子等物質(zhì)在BF各個(gè)層面也呈現(xiàn)不均一性，使得各層BF菌生理活性及耐藥水平也表現(xiàn)出不均一性，最終控制了BF的發(fā)展成熟和整體生物學(xué)行為。這種不均一性可能是BF的“保護(hù)效應(yīng)(insurance effects)”，是細(xì)菌生存的重要策略［9］，它使BF無(wú)論受到作用于那個(gè)代謝環(huán)節(jié)的抗微生物因子的攻擊，都會(huì)有一些細(xì)菌存活“重建家園”。ISA軟件通過(guò)TE參數(shù)反映了BF結(jié)構(gòu)發(fā)展過(guò)程中這種不均一性的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，TE值逐漸增大，說(shuō)明在一定范圍內(nèi)，伴隨BF發(fā)展成熟，BF的不均一度愈來(lái)愈強(qiáng)，結(jié)構(gòu)越來(lái)越復(fù)雜，對(duì)外界環(huán)境變化的抵抗能力也加強(qiáng)。

ISA軟件具有較強(qiáng)的分析功能，根據(jù)美國(guó)Montana州立大學(xué)生物膜工程中心的研究積累發(fā)現(xiàn)，平面參數(shù)中以AP、ADD最有實(shí)用價(jià)值，這兩個(gè)參數(shù)能直觀地描述BF的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)情況；而結(jié)構(gòu)參數(shù)中以TE最有實(shí)用價(jià)值，可用于不同BF的比較分析。ISA還能提供FD、MDD、AVRL、AHRL、E、H等參數(shù)，但是它們與BF發(fā)展的潛在關(guān)系尚不明確，有待于進(jìn)一步驗(yàn)證［10］。

本實(shí)驗(yàn)還利用CLSM的三維重建功能對(duì)部分模型進(jìn)行了三維重建，得到了PAO1菌株BF的三維立體圖像，圖像反映BF是一個(gè)多樣，開(kāi)放、不均一的結(jié)構(gòu)，與ISA軟件分析結(jié)果一致。

需要說(shuō)明，外源基因表達(dá)蛋白質(zhì)，需消耗宿主細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)物、能量及相關(guān)酶等，是宿主細(xì)胞的額外負(fù)組，可導(dǎo)致重組質(zhì)粒穩(wěn)定性降低［11］，而B(niǎo)F中底層細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)最差，可能影響了GFP的充分表達(dá)。Leff等［12］亦報(bào)道，在低營(yíng)養(yǎng)條件下的河水中，GFP質(zhì)粒可能丟失或不表達(dá)。

因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外建立PAO1菌株BF模型，結(jié)合CSLM成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)PAO1菌株BF的原位、動(dòng)態(tài)觀察，并利用ISA軟件對(duì)獲得的圖片堆進(jìn)行BF空間結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的定量分析，比較客觀地說(shuō)明BF形成過(guò)程中空間結(jié)構(gòu)變化，為進(jìn)一步深入認(rèn)識(shí)細(xì)菌BF結(jié)構(gòu)及有效控制細(xì)菌BF形成提供新的研究思路和技術(shù)平臺(tái)，這對(duì)于臨床上控制生物材料相關(guān)性感染具有重大意義。

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