作者：陳波曼 余加林 劉官信 胡琳燕 李芳 楊華

【摘要】 目的 探討銅綠假單胞菌細菌生物膜(biofilm，BF)形成發(fā)展過程中空間立體結(jié)構(gòu)變化，以及BF形成過程中與其生物學行為之間的相互聯(lián)系。方法 體外建立6h和1、3及6d等4個時間組銅綠假單胞菌PAO1菌株BF模型，通過綠色熒光蛋白(green fluorescence protein，GFP)標記，結(jié)合激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscopy，CLSM)攝取BF形成發(fā)展各階段不同層面的圖片堆，經(jīng)圖像結(jié)構(gòu)分析軟件(image structure analyer，ISA)分析獲得PAO1菌株BF相關(guān)空間結(jié)構(gòu)參數(shù)定量化數(shù)據(jù)。結(jié)果 ①CLSM結(jié)合GFP標記，實現(xiàn)了對PAO1菌株BF動態(tài)形成過程的觀察；②ISA軟件定量化分析顯示，隨著BF發(fā)展，厚度不斷增加，前3d增加程度(19.6μm)明顯大于后3d(6.1μm)，區(qū)域孔率(areal porosity，AP)、平均擴散距離(average diffusion distance，ADD)和結(jié)構(gòu)熵(textural entropy，TE)在BF形成的6h和6d分別為：0.98±0.01和0.92±0.02，呈現(xiàn)下降趨勢；1.00±0.009和1.06±0.027，雖變化幅度不大，但亦呈現(xiàn)逐漸增加趨勢；0.7±0.08和4.3±0.09，呈明顯上升趨勢。結(jié)論 ISA程序可以表征PAO1菌株BF的空間結(jié)構(gòu)特征，對細菌BF結(jié)構(gòu)的定量化分析也有助于探索BF形成過程與其生物學行為之間的相互聯(lián)系。

【關(guān)鍵詞】 生物膜； 銅綠假單胞菌； 定量分析； 結(jié)構(gòu)

ABSTRACT Objective To quantify the sequential development of biofilm spatial structure in biofilm process with Image Structure Analyer (ISA) software， which will provide assistant to further research on the biological behavior of biofilm. Methods P.aeruginosa PAO1 biofilm model in vitro was constructed on glass slice and biofilm development was monitored in different time intervals (6 hours， 1 day， 3 days and 6 days). The fluorescence images stack of different layer in biofilm model were obtained by confocal laser scanning microscopy (CLSM)， based on fluorophores from PAO1 with green fluorescent protein (GFP) genetically tagged. Quantitative parameters describing biofilm spatial structure could be acquired after the image information was calculated by ISA software. Results ①The PAO1 biofilm process was investigated successfully by CLSM after genetically tagged with GFP. ②The quantitative data from ISA software showed that the thickness of biofilm accumulated during biofilm growth， the rate was more obvious during the first 3 days than the latter 3 days (19.6μm vs. 6.1μm); meanwhile the areal porosity (AP) decreased from 0.98±0.01 at 6h to 0.92±0.02 at 6d， the average diffusion distance (ADD) increased slightly from 1.00±0.009 at 6h to 1.06±0.027 at 6d; the textural entropy (TE) increased from 0.7±0.08 at 6h to 4.3±0.09 at 6d. Conclusions The ISA software could provide useful information of bacterial biofilm spatial structure in PAO1 biofilm process. Quantifying bacterial biofilm structure permitsed correlating biofilm development with biofilm performance.

KEY WORDS Biofilm; Pseudomonas aeruginosa; Quantitative analysis; Structure

長久以來，人們對細菌的認識停留在浮游態(tài)水平上，但自然界中99%的細菌以生物膜(biofilm，BF)的形式存在。細菌BF是細菌為適應(yīng)生存環(huán)境黏附惰性或活性材料表面形成的一種與浮游細胞相對應(yīng)的生長方式，具有環(huán)境適應(yīng)能力更強，抵抗吞噬細胞作用，逃避宿主免疫，尤其耐藥性極強等生物學特性，而BF的許多特性均與其特殊形態(tài)結(jié)構(gòu)有關(guān)。銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，Pa)是我國醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染及重癥監(jiān)護病房感染的重要條件致病菌，近年來研究證明，該菌極易形成BF［1］，臨床上，有BF表型的Pa往往引起難以治愈的嚴重感染。以往研究多采用光鏡、掃描或透射電鏡等觀察細菌BF結(jié)構(gòu)，但樣本在脫水、固定、染色等處理過程中易發(fā)生結(jié)構(gòu)扭曲及關(guān)系改變。本實驗通過建立體外PaO1菌株BF模型，結(jié)合綠色熒光蛋白(GFP)標記技術(shù)，運用激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscopy，CLSM)攝取BF發(fā)展成熟各階段不同層面的圖像，所獲圖片堆經(jīng)圖象結(jié)構(gòu)分析(image structure analyer，ISA)軟件分析，獲得PAO1菌株BF發(fā)展過程相關(guān)空間結(jié)構(gòu)變化的數(shù)據(jù)，以期實現(xiàn)對細菌BF的無損傷觀察，并對BF空間結(jié)構(gòu)的定量化分析進行了初步探索。

1 材料和方法

1.1 試劑和菌株

銅綠假單胞菌PAO1菌株(本實驗室保存)，pGFPuv質(zhì)粒(Clontech公司)，質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒(日本BioFlux公司)，限制型內(nèi)切酶EcoRI和HindIII(寶生物公司)，ISA軟件(美國Montana州立大學Haluk Beyenal教授提供)。

(1)PAO1菌株電感受態(tài)制備 參考單志英等［2］實驗方法，將過夜增菌的PAO1菌株轉(zhuǎn)接于50ml SOB培養(yǎng)基中，37℃，200r/min振蕩培養(yǎng)；A600值為0.7左右時中止培養(yǎng)；2℃，6000r/min離心15min；菌體沉淀依次用等體積、1/2體積、1/5體積的0.3mol/L冰浴蔗糖溶液重新懸浮，洗滌菌體；2℃，6000r/min離心15min，最后根據(jù)菌體多少加入不同體積的0.3mol/L蔗糖溶液將菌體混勻；分裝成每管100μl，直接用于電轉(zhuǎn)化。

(2)pGFPuv質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化菌株篩選 感受態(tài)細胞100μl，質(zhì)粒約50ng，加入預冷的0.1cm電轉(zhuǎn)化杯中；在BioRad電轉(zhuǎn)化儀上(設(shè)置電壓1.5kv，電容25μF，電阻200Ω)進行電擊5ms；將轉(zhuǎn)化體系加入37℃溫浴的800μl SOC培養(yǎng)基中，37℃，100r/min振蕩復蘇1h；取100μl菌液涂布篩選培養(yǎng)基，37℃，16h～18h；在篩選培養(yǎng)基上生長，且紫外燈下有綠色熒光的菌落即為實驗需要的轉(zhuǎn)化菌株。

(3)轉(zhuǎn)化菌株中質(zhì)粒提取和酶切電泳鑒定 挑取表達強綠色熒光的轉(zhuǎn)化菌株單菌落，接種LBroth培養(yǎng)液，37℃振蕩培養(yǎng)過夜；按照BioFlux公司質(zhì)粒提取試劑盒產(chǎn)品說明進行質(zhì)粒的小量提取；0.8%瓊脂糖凝膠電泳；對照pGFPuv質(zhì)粒圖譜進行鑒定。用EcoRI和HindIII行雙酶切，反應(yīng)溫度為37℃；反應(yīng)體系為HindIII 1μl，EcoRI 1μl，10×M緩沖液2μl，提取質(zhì)粒17μl，作用12h；0.8%瓊脂糖凝膠電泳。

(4)pGFPuv轉(zhuǎn)化菌株建立BF模型 挑取GFP轉(zhuǎn)化PAO1菌株單菌落接種LBroth培養(yǎng)液，37℃，180r/min振蕩培養(yǎng)過夜；調(diào)整A600值至0.5；接種PAO1菌液于預先放置滅菌蓋玻片(8mm×8mm，作為黏附載體)的24孔細胞培養(yǎng)板中，每孔1ml；37℃，分4個不同時間段6h、1d、3d、6d孵育，隔日換液，每個時間段重復5次。

1.2 激光共聚焦顯微鏡觀察

氬激光(488nm)激發(fā)，物鏡×20，每個模型由外(BF游離的一面)向內(nèi)(BF和玻片相貼的一面)逐層掃描(沿Z軸掃描)，每個標本掃描8～16張。

1.3 運用ISA軟件對PAO1菌株BF結(jié)構(gòu)定量化分析

將上述獲得的各時間組模型圖片堆調(diào)入ISA3D軟件，確認圖片的完整性及順序后運行ISA及ISA3D命令，運行結(jié)果包括：①結(jié)構(gòu)參數(shù)：如結(jié)構(gòu)熵(textural entropy，TE)、結(jié)構(gòu)能(energy，E)、均一性(homogeneity，H)；②平面參數(shù)：區(qū)域孔率(areal porosity，AP)、平均擴散距離(average diffusion distance，ADD)、最大擴散距離(maximum diffusion distance，MDD)等指標；③其它參數(shù)：如生物量(biovolume，BV)、比表面積(surface area between biomass and void，SA)、單位面積生物膜體積(biomass volume to surface area ratio，V2SA)等［3］。輸出數(shù)據(jù)以EXCEL格式保存。

2 結(jié)果

2.1 GFP標記的PAO1菌株構(gòu)建與發(fā)光表型觀察

通過電轉(zhuǎn)化方法對PAO1菌株進行了pGFPuv標記。轉(zhuǎn)化菌株自然光下即可見綠色熒光，在紫外燈下發(fā)出強綠色熒光；熒光顯微鏡下，轉(zhuǎn)化菌株菌體發(fā)出明亮的綠色熒光，細菌形態(tài)呈短棒狀，提示pGFPuv已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入了PAO1菌株中，該轉(zhuǎn)化菌株可以作為BF空間結(jié)構(gòu)定量化分析研究的模式菌。

2.2 轉(zhuǎn)化菌株質(zhì)粒提取鑒定及雙酶切鑒定

轉(zhuǎn)化菌株抽提質(zhì)粒后，電泳結(jié)果顯示在2000和3500bp之間有一條約3300bp帶，條帶與質(zhì)粒大小吻合。提取的質(zhì)粒進行EcoRI和HindIII雙酶切，電泳顯示在2000和3500bp之間有一條約2500bp帶，在500和1000bp之間有一條約800bp帶，與預期結(jié)果吻合，提示pGFPuv已成功轉(zhuǎn)入PAO1菌株，并以游離質(zhì)粒形式表達。

2.3 CLSM觀察GFP標記BF模型

6h左右，PAO1已經(jīng)在玻片上黏附聚集，發(fā)出綠色熒光；1d組模型多為綠色熒光，細菌呈微菌落聚集，已具有一定厚度；隨著時間延長，BF變厚，3d組及6d組模型肉眼可見一層灰白色膜狀物平鋪于玻片上，鏡下可見大片狀BF，細菌密集，層疊如積云狀，棉絮樣，具備復雜空間結(jié)構(gòu)，細菌之間有許多非綠色的黑色區(qū)域，呈管道或泡狀。

2.4 ISA軟件結(jié)構(gòu)定量化分析

對各時間組模型的平均厚度、AP、ADD及TE進行統(tǒng)計，隨著培養(yǎng)時間延長，各時間組PAO1菌株BF的平均厚度不斷增加，增加程度在前3d比較明顯，每個時間組之間增加10μm以上，3d后增加速度減慢，3d組與6d組BF的平均厚度僅增加了6μm(表1)；隨著培養(yǎng)時間延長，各時間組模型的AP值呈下降趨勢，由最初的0.98下降到0.92；TE值由最初的0.7上升到4.3，增幅接近6倍；ADD值雖然變化幅度不大，但是呈上升趨勢(表1)。表1 各時間組PAO1菌株BF的平均厚度、AP、ADD及TE值

3 討論

細菌BF是一個三維立體空間結(jié)構(gòu)的生態(tài)系，是一個具有高度結(jié)構(gòu)性、協(xié)調(diào)性和功能性的組織群體，BF結(jié)構(gòu)的維持對BF生物學行為具有重要意義。深入認識BF的結(jié)構(gòu)特點，不能停留在某一平面的形態(tài)描述，還需要對BF的空間結(jié)構(gòu)展開定量化分析。由于報道基因中常用的綠色熒光蛋白(GFP)的基因具有基因小、性質(zhì)穩(wěn)定、對細胞安全等優(yōu)點，本實驗運用電轉(zhuǎn)化方法，成功地將pGFPuv轉(zhuǎn)入PAO1中，建立體外PAO1菌株BF模型，運用CLSM觀察以保證細菌BF結(jié)構(gòu)的完整性，連續(xù)檢測其在玻片表面定植形成BF的過程，結(jié)合計算機圖像處理分析系統(tǒng)，對BF結(jié)構(gòu)進行定量化分析。

BF形成發(fā)展是一個動態(tài)過程，生長周期一般分為5個階段：最初的定植階段、不可逆黏附階段、結(jié)構(gòu)分化階段、發(fā)展成熟階段和解聚再定植階段［4］。本實驗通過CLSM連續(xù)動態(tài)觀察PAO1菌株BF形成，基本反映了這樣一個過程：6h左右PAO1菌株開始在玻片表面黏附聚集，1d左右初步形成BF，3d時BF基本形成，具備三維結(jié)構(gòu)，此后BF逐漸發(fā)展達到一個平衡，這與文獻報道基本一致［5］。隨著培養(yǎng)時間延長，BF厚度逐漸增加，但趨勢漸緩，可能與BF營養(yǎng)滲透屏障有關(guān)。

本實驗還采用ISA軟件獲得了BF空間結(jié)構(gòu)參數(shù)的定量化數(shù)據(jù)，實現(xiàn)了對BF基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)特征的定量化分析。該軟件由美國Montana州立大學的生物膜工程中心2000年開發(fā)，采用自動定閾系統(tǒng)［6］，降低了圖片處理中主觀因素的影響，對BF的二維和三維結(jié)構(gòu)進行更多參數(shù)的測定和比較。

ISA提供厚度參數(shù)顯示，GFP標記的BF模型平均厚度在前3d內(nèi)增長速度明顯快于后3d，提示BF生長速度的不均一性。細菌黏附后初期，BF迅速增厚，但隨著時間延長，BF厚度增加趨勢減慢，其原因除與營養(yǎng)限制有關(guān)外，也可能是BF增加到一定厚度后，為保證底層細菌獲得一定的營養(yǎng)物質(zhì)而維持自身結(jié)構(gòu)，對自身發(fā)出密度感應(yīng)(quorum sensing，QS)信號產(chǎn)生反應(yīng)，達到平衡狀態(tài)。

本實驗對BF的觀察中還發(fā)現(xiàn)BF并非一層單純的致密膜，其內(nèi)部存在很多黑色相互交通的間隙及孔道，Stoodley等［7］認為這些大、小不一的間隙和通道是BF結(jié)構(gòu)的重要組成部分，其中充滿了胞外多糖和蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，與深層BF中的細菌生長關(guān)系密切。Wood等［8］在牙菌斑BF也發(fā)現(xiàn)類似的間隙和通道貫穿于整個BF之中，其功能類似初級循環(huán)系統(tǒng)，活菌緊緊圍繞在這些孔和通道的周圍，保證營養(yǎng)的獲取和排除代謝廢物。此外，BF還可以借這些通道來感知QS信號。BF這種結(jié)構(gòu)特點決定BF具有一個能適應(yīng)多種理化變化的內(nèi)環(huán)境。

ISA軟件通過區(qū)域孔率(AP)和平均擴散距離(ADD)這兩個參數(shù)，客觀反映BF結(jié)構(gòu)發(fā)展過程中間隙孔道及營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)距離變化。本實驗發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)時間延長，BF厚度逐漸增加，AP逐漸減低，ADD逐漸增加，提示BF逐漸發(fā)展，細菌聚集越來越致密，BF結(jié)構(gòu)中間隙及通道的孔徑和數(shù)目減少，相應(yīng)營養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)距離增加，細菌物質(zhì)代謝受到一定限制而將逐漸發(fā)展達到一個相對穩(wěn)態(tài)。

BF不僅在結(jié)構(gòu)上存在多樣、開放、不均一性特點，而且環(huán)境中營養(yǎng)物質(zhì)、代謝產(chǎn)物、信號分子等物質(zhì)在BF各個層面也呈現(xiàn)不均一性，使得各層BF菌生理活性及耐藥水平也表現(xiàn)出不均一性，最終控制了BF的發(fā)展成熟和整體生物學行為。這種不均一性可能是BF的“保護效應(yīng)(insurance effects)”，是細菌生存的重要策略［9］，它使BF無論受到作用于那個代謝環(huán)節(jié)的抗微生物因子的攻擊，都會有一些細菌存活“重建家園”。ISA軟件通過TE參數(shù)反映了BF結(jié)構(gòu)發(fā)展過程中這種不均一性的變化。實驗結(jié)果顯示隨著培養(yǎng)時間延長，TE值逐漸增大，說明在一定范圍內(nèi)，伴隨BF發(fā)展成熟，BF的不均一度愈來愈強，結(jié)構(gòu)越來越復雜，對外界環(huán)境變化的抵抗能力也加強。

ISA軟件具有較強的分析功能，根據(jù)美國Montana州立大學生物膜工程中心的研究積累發(fā)現(xiàn)，平面參數(shù)中以AP、ADD最有實用價值，這兩個參數(shù)能直觀地描述BF的結(jié)構(gòu)特點及營養(yǎng)供應(yīng)情況；而結(jié)構(gòu)參數(shù)中以TE最有實用價值，可用于不同BF的比較分析。ISA還能提供FD、MDD、AVRL、AHRL、E、H等參數(shù)，但是它們與BF發(fā)展的潛在關(guān)系尚不明確，有待于進一步驗證［10］。

本實驗還利用CLSM的三維重建功能對部分模型進行了三維重建，得到了PAO1菌株BF的三維立體圖像，圖像反映BF是一個多樣，開放、不均一的結(jié)構(gòu)，與ISA軟件分析結(jié)果一致。

需要說明，外源基因表達蛋白質(zhì)，需消耗宿主細胞的營養(yǎng)物、能量及相關(guān)酶等，是宿主細胞的額外負組，可導致重組質(zhì)粒穩(wěn)定性降低［11］，而BF中底層細菌營養(yǎng)物質(zhì)最差，可能影響了GFP的充分表達。Leff等［12］亦報道，在低營養(yǎng)條件下的河水中，GFP質(zhì)粒可能丟失或不表達。

因此，本實驗通過體外建立PAO1菌株BF模型，結(jié)合CSLM成功實現(xiàn)了對PAO1菌株BF的原位、動態(tài)觀察，并利用ISA軟件對獲得的圖片堆進行BF空間結(jié)構(gòu)特點的定量分析，比較客觀地說明BF形成過程中空間結(jié)構(gòu)變化，為進一步深入認識細菌BF結(jié)構(gòu)及有效控制細菌BF形成提供新的研究思路和技術(shù)平臺，這對于臨床上控制生物材料相關(guān)性感染具有重大意義。

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