作者：包翠芬 劉霞 魏嘉 梁佳 秦書儉

【摘要】 目的： 探討cjun N末端激酶(JNK)在胚胎小鼠腦發(fā)育中的作用。方法：按受孕時間將昆明小鼠隨機分為6組，分別為胚齡10（E10）、12（E12）、14（E14）、16（E16）、18d（E18）組、新生組（P0），采用免疫印跡技術和光密度分析法對各組小鼠腦JNK進行定量檢測，以測得的JNK最大量為1(100%)，計算蛋白相對含量。 結果：免疫印跡法測得E10、E12、E14、E16、E18及P0組JNK1含量分別為24.57%、46.62%、62.99%、82.06%、100%、89.65%，JNK2/3含量分別為58.89%、51.37%、28.67%、20.33%、6.54%、5.03%。結論： JNK在胚胎發(fā)育期間呈明顯的變化規(guī)律，提示JNK可能在小鼠大腦的發(fā)生與發(fā)育中起重要作用。

【關鍵詞】 小鼠； 腦； JNK； 免疫印跡

免疫印跡技術原理是將凝膠電泳的分辨力和免疫化學檢測的特異性融為一體，首先借助凝膠電泳將蛋白質抗原分離，然后將凝膠中的蛋白質轉印至膜上，使之成為被分離蛋白的一個拷貝，抗原的位置即可用特異性抗體確定。目前免疫印跡技術是科研中常用的蛋白定量檢測方法，該方法具有高效、靈敏等特點。本實驗應用免疫印跡法對胚胎小鼠大腦組織cjun N末端激酶(cJun Nterminal Kinase，JNK)的蛋白含量進行檢測，以探討JNK在胚胎小鼠腦發(fā)育過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

取成年昆明小鼠（遼寧醫(yī)學院實驗動物中心提供），按小鼠孕期隨機分為E10、E12、E14、E16、E18及P0組［1］。每組10只。

1.2 主要試劑及儀器

兔抗小鼠JNK單克隆抗體（NeoMarker公司），細胞裂解液、PowerPac 3000電泳儀、Transblot SD半干轉膜儀(美國BioRad公司)。

1.3 免疫印跡檢測步驟

分別取胚齡10、12、14、16、18天及新生鼠大腦稱重，PBS沖洗，迅速置于液氮冷凍，-70℃冰箱保存。取冷凍腦組織，加入3倍體積的細胞裂解液，0℃下剪碎、勻漿，將組織勻漿液靜置30min，4℃、12000rpm 離心10min，留取上清液。用Bradford法測定蛋白含量，分裝成每離心管中含10μg蛋白，-20℃冰箱保存。

配制10%分離膠和5%濃縮膠，取含10μg腦組織蛋白細胞裂解上清液，加入10μlSDS樣品緩沖液，100℃加熱3min，離心。取上述裂解液加入電泳膠樣品槽，100V電壓下電泳，待樣品到達合適位置，停止電泳，將膠板取下，轉膜液洗滌10～30min。將膠與0.45μmPVDF膜(用前置于甲醇內(nèi)浸透5min左右，再放入轉膜液中至少5min)置于厚濾紙(已用轉膜液浸泡)之間，趕盡氣泡，常溫下半干轉印，轉印完成后將PVDF膜用TBST(TBS-1% Tueen20溶液)沖洗，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1～2h。與一抗(兔抗小鼠JNK抗體，稀釋度為1∶400)4℃孵育過夜，TBST洗脫3次，每次至少5min； 再與二抗(堿性磷酸酶標記的羊抗兔IgG抗體，稀釋度為1∶200)室溫孵育1h，TBST溶液洗脫3次， 每次至少5min；NBT/BCIP顯色；掃描電泳條帶，輸入電腦，用光密度分析軟件分析電泳條帶光密度。

1.4 統(tǒng)計學分析

應用SPSS10.0軟件分析，所有數(shù)據(jù)均用 ±s表示。多組間差異顯著性檢驗采用單因素方差分析。

2 結果

Wester blot電泳條帶圖光密度分析：由光密度分析得之，E18組JNK1含量最高，以該組百分數(shù)計做100％，計算各組JNK表達相對含量（圖1、表1）。JNK1于E10組含量最低，隨胚齡的增長其含量逐漸升高，至E18組升至高峰，至P0組含量略微降低；JNK2/3于E10組含量最高，隨胚齡的增長JNK含量逐漸降低，至P0組降至最低水平。表1 昆明小鼠生后腎JNK Wester blot電泳條帶光密度百分數(shù)(％)注：* 與前一胚齡組比較，P<0.01。

3 討論

JNK家族是絲裂素活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinases， MAPK) 超家族成員之一，屬于進化上保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)主要的信號轉導通路之一。JNK最早提出于1991年，研究者發(fā)現(xiàn)，用紫外線照射細胞后，一種蛋白激酶能夠使cJun氨基末端活性區(qū)Ser63和Ser73發(fā)生磷酸化，據(jù)此把該蛋白激酶稱為cJun氨基末端激酶(cJunNterminal kinase，JNK)［2］?，F(xiàn)已證實有三組編碼JNK的基因，在人類分別為JNK1，JNK2，JNK3，在鼠類也存在相應的基因，其中JNK1和JNK2/3的分子量分別為46kD和54kD，且表達廣泛。JNK家族可被細胞因子、生長因子、應激(如電離輻射、滲透壓、熱休克和氧化損傷)等多種因素激活，大量實驗提示JNK信號通路在細胞凋亡、應激反應以及多種人類疾病的發(fā)生與發(fā)展中起著至關重要的作用，因此JNK信號通路是正常與疾病狀態(tài)時細胞的一個重要調節(jié)靶點。

本實驗結果顯示，JNK2/3的表達隨著胚齡的增長而呈現(xiàn)下降趨勢，至出生時達最低水平；而JNK1的表達則相反，隨著胚齡的增長呈現(xiàn)上升趨勢，至E18組達到高峰，但出生時又略有下降，可能與出生時應激反應有關，以上結果提示JNK與小鼠大腦的發(fā)生與發(fā)育過程是密切相關的。Oliver等研究發(fā)現(xiàn)JNK的磷酸化促進了胚胎時期體軸的形成［3］。Kuan等研究表明，缺失JNKl或JNK2或JNK3或JNK1/JNK3或JNK2/JNK3的小鼠均正常存活，而缺失JNK1/JNK2導致胚胎死亡，表現(xiàn)出嚴重的腦內(nèi)凋亡調節(jié)障礙，即在早期胚胎發(fā)育過程中，后腦凋亡減少并呈現(xiàn)畸形，但前腦的形態(tài)發(fā)生有明顯增強的凋亡反應，提示JNKl和JNK2調節(jié)腦發(fā)育早期區(qū)域特異的凋亡［4］。Liu MG等根據(jù)小鼠傷害性疼痛過程中JNK的三種亞型在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達的部位不同，推斷出三種亞型在功能上既有差異，又相互聯(lián)系［5］。因此，研究不同胚齡時期小鼠大腦（海馬和皮層神經(jīng)元）發(fā)育過程中JNK家族的基因表達趨勢及其調控機制，是探索哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生、發(fā)育分子生物學機理的有效途徑之一。

【參考文獻】 1 王靈均，郭敏，陳河.小鼠腦小體的形態(tài)發(fā)生.解剖學報，2005，36(1):99～102. 2 Yelena Lyustikman， Hiroyuki Momota， William Pao， et al. Constitutive Activation of Raf1 Induces Glioma Formation in Mice. Neoplasia， 2008，10(5): 501～510. 3 Oliva AA Jr， Atkins CM， Copenagle L，et al. Activated cJun Nterminal kinase is required for axon formation. J Neurosci， 2006，26(37):9462～9670. 4 Toyoda H， Zhao MG， Xu H， et al.Requirement of extracellular signalregulated kinase/mitogen activated protein kinase for longterm potentiation in adult mouse anterior cingulate cortex. Mol Pain， 2007，3 (1):36. 5 Liu MG， Zhang FK， Guo SW， et al.Phosphorylation of cJun Nterminal kinase isoforms and their different roles in spinal cord dorsal horn and primary somatosensory cortex.Neurosci Lett， 2007，427(1):39～43.