作者：穆長征 王小梅 陶仕英 劉霞 包翠芬

【摘要】 目的：探討神經型一氧化氮合酶在胚胎小鼠妊娠不同時期腎臟發育中的意義。方法：選用成年健康昆明小白鼠，按雌雄比例3：1同窩飼養，采用檢查陰道栓脫落的方法確定雌鼠受孕時間。選取胚齡12天(ED12)、14天(ED14)、16天(ED16)、18天(ED18)的胎鼠及出生時(PD0)仔鼠，分5組，每組各6只母鼠，每只母鼠取2只胎鼠或仔鼠，剖腹取腎臟，用免疫印跡技術（Western blot ）及光密度分析系統分別對各組胎鼠或仔鼠腎臟內nNOS進行定量檢測。結果 ： Western blot及光密度分析顯示， ED14組腎臟nNOS含量最少，隨后逐漸增多，PD0組腎臟nNOS含量最多。結論：胚胎小鼠腎臟nNOS在胚胎第14天開始呈陽性表達，以后含量逐漸升高，出生時含量最高，表明nNOS在胚胎小鼠腎臟發育的早期階段起重要作用。

【關鍵詞】 神經型一氧化氮合酶； 胚胎小鼠； 腎臟

一氧化氮合酶（Nitric Oxide Synthase， NOS）是一氧化氮（NO）合成的限速酶，是調節NO的重要環節。NO通過NOS產生，是一種可作為信使分子的自由基氣體［1］，可激活可溶性鳥苷酸環化酶，通過生成cGMP而發揮作用。NOS可分為內皮型（endothelial NOS，eNOS）、神經型（neuronal NOS， nNOS）和誘導型（inducible NOS，iNOS）3類。NO在腎臟血流動力學和腎臟多種生理功能中的作用決定NOS的活性改變，NO可通過調節腎小球毛細血管壓和管球反饋來調節腎血流量，是有效調節腎臟的血液動力學的舒張因子，能對抗縮血管物質，參與調節血管張力。盡管國內外學者對成年腎臟NOS的表達進行大量的研究，但nNOS在胚胎腎發育過程中動態表達尚未見報道。本實驗通過觀察妊娠不同時期胚胎小鼠腎臟nNOS的表達，旨在探討nNOS在胚胎小鼠腎臟早期發育中的意義。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

昆明小白鼠，由遼寧醫學院實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑

丙烯酰胺、N，N-亞甲基雙丙烯酰胺、甘氨酸購于北京中杉金橋生物技術有限公司；Tween-20、Tris、SDS和硝酸纖維素膜購于華美公司。

1.3 動物培養與分組

選用成年健康昆明小白鼠，按雌雄比例3：1同窩飼養，采用檢查陰道栓脫落的方法確定雌鼠受孕時間。以觀察到陰道栓脫落的最早時間計為0天。記錄受孕時間，然后將孕鼠分籠飼養，每日早8時、晚5時觀察生產情況，以觀察到仔鼠出生的最早時間計為出生時。選取胚齡12天(ED12)、14天(ED14)、16天(ED16)、18天(ED18)的胎鼠及出生時(PD0) 仔鼠，分5組，每組各6只母鼠，每只母鼠取2只胎鼠或仔鼠。

1.4 Western blot測定腎臟nNOS含量

各組胎鼠或仔鼠脊椎離斷后剖腹取左腎，PBS沖洗，濾紙吸干，將完整左腎入液氮迅速冷凍，-70℃冰箱保存待用。取冷凍待用的左腎組織，加入3倍體積的細胞裂解液，0℃下剪碎、勻漿，將組織勻漿液靜止30min，冷凍離心機（10000r/min）離心10min，取15μl上清液，用Bradford 法測定蛋白含量后，分裝成每離心管中含10μg蛋白，-20℃保存備用。

配置8%SDS聚丙烯酰胺分離膠和5%的濃縮膠，取10μg腎組織蛋白細胞裂解上清液，加入10μl SDS 樣品緩沖液，100℃加熱3 min，離心。然后取上述裂解液，加到電泳膠的樣品孔，100V電壓下電泳，待指示劑達到分離膠時，將電壓增至200V，直到指示劑達到膠的底部。將膠板取下，在轉移緩沖液中洗滌10min，將膠與0.45μm硝酸纖維素膜置于濾紙與海綿之間，趕盡氣泡，常溫下，半干轉印。至轉印好的硝酸纖維素膜，TBS（Tris 鹽緩沖液）沖洗2遍，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉4℃過夜，分別與一抗（兔抗鼠 nNOS多克隆抗體）（稀釋度為1：400），4℃孵育過夜，TBST（TBS-0.5%Tween-20溶液)洗脫3次，再與二抗-HRP標跡的羊抗兔IgG抗體（稀釋度為1：200）室溫孵育1h，以TBST溶液洗脫3次后與DAB試劑顯色，掃描電泳條帶，用Band Leader軟件分析電泳條帶光密度。

1.5 統計學分析

應用SPSS11.5統計軟件包進行統計分析，所有數據均以均數±標準差（x±s）形式表示，采用雙因素方差分析和q檢驗。以P＜0.05為差異有顯著性意義。

2 結果

以測得的nNOS最大值為1，計算各組nNOS表達相對含量(百分數)。PD0組含量最高（100%）， ED14組nNOS含量最低（46.6±2.8%，兩者比較P＜0.01)，ED16組含量升高（為57.3±3.6 %，與ED14組比較P＜0.05），ED18組含量進一步升高（為77.5±3.2 %，與ED16組比較P＜0.01， 與PD0組比較P＜0.01）。胚胎小鼠不同發育階段nNOS含量分析用Western blot電泳條帶和光密度百分數表示。 見表1、圖1、圖2。表1 小鼠不同發育階段腎臟nNOS表達的光密度（%）（略）注：*與ED14組比較P＜0.05；▲與ED14組比較P＜0.01，#與ED16組比較P＜0.01；△與ED18組比較P＜0.01。

3 討論

NO對腎血流量和局部微循環具有重要的調節作用［2］。Solhaug［3］證實，NO是唯一在新生動物中具有血管舒張功能的因子。他認為與成年腎臟相比，由于新生腎臟含有大量高活性血管收縮因子，其中包括腎素、血管緊張素系統，這些因素導致新生腎臟血管阻力（RVR）高，RBF和GFR低，且處于低氧環境使腎臟血管阻力（RVR）進一步增高［4，5］，為了維持胚胎小鼠腎臟早期發育階段的腎血流量，保護腎免受損傷，NO作為有效的調節腎臟血液動力學的舒張因子，能對抗縮血管物質，參與調節血管張力，維持基本腎血流量和增加腎小球濾過率［6］。在腎臟早期發育過程中，NO主要通過舒血管效應調節腎RBF與GFR，在調節胚胎腎臟功能方面起著重要作用。

本實驗的免疫印跡結果發現，胚胎小鼠不同發育階段中，出生時的腎臟nNOS含量最高。nNOS是一種結構酶，其表達越多，產生NO越多，作為胚胎小鼠體內唯一的血管舒張功能因子，通過對抗高活性血管收縮因子特別是血管緊張素Ⅱ的作用，增加腎RBF及GFR，調節腎臟正常的生理活動。一般認為胚胎動物的RBF最小，腎臟nNOS含量最高，以后逐漸降低，這是由于隨著腎功能的自我完善、RBF的增加造成的。因此胚胎小鼠的高RVR、低RBF、低GFR的生理特點是促使nNOS表達的主要因素。此外nNOS的表達還與細胞自身的生長發育與增殖、母體的環境以及腎臟自身血液動力學相關。出生時動物具有高的雌激素和雌激素的受體，不同實驗發現雌激素能通過增加基因的轉錄水平上調nNOS mRNA表達，因而在胚胎小鼠nNOS的表達可能受母體的雌激素影響［7，8］。另外生長因子也能上調nNOS的表達，轉錄生長因子-β1（TGF-β1）在腎發育中高度表達，在細胞的培養中，它可以直接刺激nNOS的表達［9］。更有一些學者認為［10］，低氧參與nNOS的合成與調節，胚胎動物一般處于缺氧狀態，它能上調nNOS的表達。

綜上所述，我們認為胚胎小鼠RBF變化與nNOS有密切關系。由此推斷在腎臟功能發育的早期，nNOS對腎臟血液動力學的調節起著重要作用。