作者：鐘振國，李學堅，董明姣，劉布鳴，陳明生，韋勇漢，陸盛勝，鐘益寧，黃金蘭，韋小清

【摘要】 目的對余甘子葉中的沒食子酸進行分析研究，建立定性定量分析方法，為余甘子葉的質量標準制定提供方法和依據。方法采用薄層色譜進行定性鑒別；定量方法采用液相色譜測定余甘子葉中沒食子酸的含量：以C18柱，流動相：甲醇-0.2%磷酸(3∶97)；流速1.0 ml/min ；檢測波長為269 nm；外標法定量。結果沒食子酸在0.23～1.38 μg范圍內呈線性關系，平均回收率為102.1%（RSD=1.38%）；分別對不同產地的樣品進行了測定。結論該方法簡便、準確，專屬性強，重復性、回收率好，可作為余甘子葉藥材的質量控制方法。

【關鍵詞】 余甘子葉 沒食子酸 薄層色譜 液相色譜

余甘子葉為大戟科葉下珠屬植物余甘子Phyllanthus embllca L.的葉，余甘子樹廣泛分布于我國的廣西、廣東、福建、貴州、云南等地。余甘子為傳統民族用藥，具有清熱涼血、消食健胃、生津止咳之功效，用于血熱血瘀、消化不良、腹脹、咳嗽、喉痛、口干［1］。余甘子中含沒食子酸并作為檢測指標［1］，但目前對余甘子葉的化學研究不多，其分析方法研究未見報道。本課題組采用薄層色譜法和液相色譜法，以主要成分之一的沒食子酸為對照，對余甘子葉進行了定性定量分析方法研究，并對不同產地的樣品進行了分析比較，為該植物的進一步開發利用提供基礎化學數據，為余甘子葉藥材及其制劑的質量標準研究奠定基礎和依據。

1 器材

1.1 儀器與試藥

美國Waters 515 HPLC Pump、2487 DualλAbsor bance Detector液相色譜儀，威瑪龍色譜工作站；KQ5200B型超聲清洗器；硅膠G，青島海洋化工廠出品沒食子酸對照品（110831-200302），由中國藥品生物制品檢定所提供；水為超純水，甲醇為色譜純；其它試劑均為分析純。

1.2 樣品

余甘子葉采自廣西各地，經廣西中醫學院劉壽養教授鑒定為大戟科葉下珠屬植物余甘子Phyllanthus embllca L.的葉。晾干。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別

取余甘子葉粉碎，稱取2 g，加水煮1.5 h，濾過，濾液用鹽酸調pH值至2，用乙醚連續萃取兩次，取乙醚層，揮干，殘渣加醋酸乙酯1 ml使溶解，作為供試品溶液。另取余甘子葉對照藥材同法制成對照藥材溶液。再取沒食子酸對照品，加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗，吸取上述各種溶液各1～2 μl，分別點于同一含羧甲基纖維素納為粘合劑的硅膠G薄層板上，以甲醇（水飽和）－甲酸乙酯－甲酸（5∶4∶1）為展開劑，展開，取出晾干，噴以5%FeCl3溶液。供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應的位置上顯相同顏色的斑點，Rf=0.45，見圖1。經多批樣品試驗，薄層色譜的重復性好，可作為余甘子葉的定性鑒別方法。

2.2 含量測定

2.2.1 液相色譜測試條件色譜柱：迪馬C18柱，流動相：甲醇-0.2%磷酸(3∶97)，流速1.0 ml/min，檢測波長269 nm，柱溫室溫，進樣量10 μl。

2.2.2 色譜條件與系統適用性實驗檢測波長：取沒食子酸對照品適量，以流動相為溶劑，用紫外分光光度計在200～350 nm波長范圍內掃描，測得沒食子酸最大吸收波長為269 nm，故檢測波長選擇269 nm。與文獻報道沒食子酸的檢測波長相同［2］。

系統適用性：在本色譜條件下，理論板數按沒食子酸峰計算不低于3 000，沒食子酸峰與相鄰組分色譜峰達到完全分離，分離度大于1.5，沒食子酸保留時間約為18 min。樣品與對照品色譜見圖2～3。

2.2.3 提取條件的選擇取同一批余甘子葉，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%的甲醇水溶液30 ml，密塞，稱定重量，分別按不同的時間超聲處理，放冷，用50%甲醇水補足減失的重量，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續濾液，注入液相色譜儀，測定沒食子酸含量，結果表明在超聲處理60，90 min與120 min的條件下余甘子葉中沒食子酸成分提取效果相差不大，為便于操作，縮短分析時間，選擇超聲時間為60 min。結果見表1。表1 余甘子葉在不同超聲處理時間測定結果（略）

2.2.4 溶液制備對照品溶液的制備：精密稱取11.5 mg沒食子酸對照品，置于10 ml容量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取0.5 ml，置于10 ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為沒食子酸對照品溶液。

供試品溶液的制備：取余甘子葉2.0 g，剪碎后精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入精密量取的50%甲醇30 ml，稱定重量，超聲1 h，放冷補重，濾過，取續濾液用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，作為供試品溶液。

2.2.5 線性關系考察精密稱取沒食子酸對照品11.5 mg，置10 ml容量瓶中，用動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 ml置于10 ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，得系列標準溶液，按上述色譜條件分別注入色譜儀，進樣10 μl，測定沒食子酸峰面積值，以沒食子酸峰面積值Y為縱坐標，沒食子酸進樣量X(μg)為橫坐標，求得沒食子酸標準曲線回歸方程為：峰面積Y=7 194 951.677 0X-63 661.600 0（n=6），r=0.999 9，表明沒食子酸進樣量在0.23～1.38 μg范圍呈良好線性關系。

2.2.6 精密度實驗取供試品溶液，連續重復進樣6次，測定樣品中沒食子酸峰面積積分值并計算相對標準偏差，測得平均值為：3 654 170，RSD= 1.42%。

2.2.7 穩定性實驗取供試品溶液，在上述色譜條件下，10 h內間隔一定時間進樣，測定樣品中沒食子酸峰面積積分值并計算相對標準偏差，測得平均值為：3 713 586，RSD=1.26%。

2.2.8 重復性實驗精密稱取同一批余甘子葉樣品各6份，按“2.2.4”項下進行操作，測定沒食子酸的含量(mg/g)并計算相對標準偏差，結果測得沒食子酸平均含量為0.780 mg/g，RSD=1.66%(n=6)。

2.2.9 加樣回收率實驗分別精密稱取已測知沒食子酸含量（0.780 mg/g）的余甘子葉樣品，剪碎，共9份，每份1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，按低(0.575 0 mg)、中(0.805 0 mg)、高(1.035 0 mg)3個不同的加入量，精密加入沒食子酸對照品溶液（0.575 mg／ml）。混勻后按供試品溶液制備和沒食子酸含量測定方法提取、測定，計算平均回收率，結果平均回收率為102.1％，RSD=1.38％。

2.2.10 樣品測定 取不同產地余甘子葉樣品，按上述方法進行含量測定。結果見表2。表2 余甘子葉中沒食子酸含量測定結果（略）

3 討論

本實驗建立了余甘子葉中沒食子酸的定性定量分析方法，方法簡便、快速，專屬性強，重復性好，可作為余甘子葉的質量控制方法。

本實驗測定了不同產地的余甘子葉，結果均能檢出沒食子酸，但含量有所差異，相差近10倍。

流動相的配比對沒食子酸的色譜峰有較大影響，甲醇-0.2%磷酸為5∶95時，沒食子酸出峰時間較快，樣品中沒食子酸峰未能與其他雜質峰有較好地分離；甲醇-0.2%磷酸為3∶97時，沒食子酸出峰時間相對較慢，但與相鄰峰的分離效果最好，色譜峰形對稱，因此選擇3∶97的流動相配比。