作者：今毅 謝文 余小萍 鄭暉

【摘要】 目的：檢測(cè)乳腺癌患者腫瘤循環(huán)DNA的含量及其p16基因5′ CpG島甲基化狀態(tài)的改變. 方法：收集61例乳腺癌患者、33例乳腺良性病變患者和27例健康志愿者的血漿樣本，抽提血漿循環(huán)DNA，以SYBR green I熒光染色法行DNA定量；利用半巢式甲基化特異性PCR技術(shù)，檢測(cè)61例乳腺癌患者血漿循環(huán)DNA和相應(yīng)癌組織p16基因5′ CpG島甲基化狀態(tài)的改變. 結(jié)果：乳腺癌患者、乳腺良性病變患者、健康自愿者腫瘤循環(huán)DNA濃度分別為（65.0±45.3）， (19.0±9.5)和(13.0±7.3) μg/L，乳腺癌患者血漿循環(huán)DNA濃度顯著高于乳腺良性病變患者和健康自愿者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05). 61例乳腺癌患者血漿循環(huán)DNA和相應(yīng)癌組織p16基因5′ CpG島甲基化狀態(tài)的改變檢出率分別為44.3%和46.2%，兩者檢出率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P>0.05). 結(jié)論：血漿腫瘤循環(huán)DNA的定量有可能成為一種新的惡性腫瘤標(biāo)志物.

【關(guān)鍵詞】 乳腺腫瘤 DNA 腫瘤 p16基因 甲基化 腫瘤標(biāo)志 生物學(xué)

0引言

隨著近年來腫瘤細(xì)胞生物學(xué)及分子生物學(xué)的深入研究，以及分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展，外周血腫瘤標(biāo)記由于檢測(cè)的方便和非侵入性己逐步替代了受到標(biāo)本采集以及無法連續(xù)監(jiān)測(cè)和隨訪追蹤等諸多限制的組織學(xué)腫瘤標(biāo)記. 而外周血循環(huán)DNA及其改變的分子生物學(xué)檢測(cè)正以其不可替代的優(yōu)點(diǎn)逐漸被人們所重視，并成為腫瘤細(xì)胞生物學(xué)及分子生物學(xué)研究中引人注目的一個(gè)亮點(diǎn)［1-4］. 循環(huán)DNA是存在于血清和血漿中的游離DNA. 近年來，日益增多的研究表明，腫瘤在生長(zhǎng)過程中能持續(xù)釋放腫瘤細(xì)胞DNA進(jìn)入外周血液. 健康人體的血清及血漿中只含有極少量的循環(huán)DNA，在炎癥及腫瘤患者外周血中循環(huán)DNA的濃度增加，伴有轉(zhuǎn)移的腫瘤患者其濃度更高于早期患者［5-7］. 對(duì)循環(huán)腫瘤DNA的檢測(cè)可分為定性和定量?jī)煞N：前者主要檢測(cè)血清和血漿中腫瘤特異性基因的改變，后者則檢測(cè)血清和血漿的DNA總量，兩者均可反映腫瘤的存在和嚴(yán)重程度. 我們從定量（檢測(cè)腫瘤循環(huán)DNA的含量）和定性（檢測(cè)腫瘤循環(huán)DNA的p16基因5′ CpG島甲基化狀態(tài)的改變）兩方面入手，對(duì)乳腺癌患者腫瘤循環(huán)DNA含量及其p16基因5′ CpG島甲基化狀態(tài)的改變進(jìn)行了研究.

1對(duì)象和方法

1.1對(duì)象武漢大學(xué)中南醫(yī)院婦瘤科和腫瘤科在200508/200605收治的61例乳腺癌患者，診斷均經(jīng)組織病理學(xué)證實(shí). 33例乳腺良性病變患者為本院婦產(chǎn)科同一時(shí)期收治的，排除其他病變. 27健康對(duì)照來自本院體檢中心，體檢正常，無疾病在身. QIAamp DNA Blood Midi Kit購(gòu)自Qiagen公司， 熒光染料SYBR green I購(gòu)自Molecular Probes公司，標(biāo)準(zhǔn)量DNA購(gòu)自Invitrogen公司， Wizard DNA Purification Resin購(gòu)自Promega公司， PCR擴(kuò)增儀為BIORAD公司，電泳儀、凝膠成相系統(tǒng)為北京六一電子儀器設(shè)備廠， FR2200紫外投射儀與可見分析裝置為上海復(fù)日科技有限公司產(chǎn)品.

1.2方法

1.2.1樣本收集所有乳腺癌病例取靜脈血5 mL置于EDTA抗凝管中，以3000 r/min，離心10 min后將上清血漿部分吸至潔凈離心管，再離心10 min，完全去除血細(xì)胞成分后置于干燥潔凈凍存管中，-80℃低溫冰箱保存?zhèn)銬NA抽提. 相同方法采集保存33例乳腺良性病變、27名健康志愿者的血液樣本.

1.2.2血漿DNA抽提和純化血漿DNA的抽提嚴(yán)格按照QIAamp DNA Blood Midi Kit(Qiagen公司，德國(guó))試劑盒的操作步驟進(jìn)行，每2 mL血漿獲得300 μL的DNA. 所有保存血漿標(biāo)本均采用同一批號(hào)的試劑盒抽提DNA以減少批間誤差并統(tǒng)一集中檢測(cè).

1.2.3血漿DNA定量取10 μL血漿DNA置透明載板，與1∶3000熒光染料SYBR green I (Molecular Probes公司，美國(guó))等比例稀釋并充分混勻后置于紫外與可見光成像分析系統(tǒng)中，在激發(fā)光波長(zhǎng)為345 nm， 吸收波長(zhǎng)500 nm的條件下，攝影獲取圖像，經(jīng)軟件系統(tǒng)分析讀取其發(fā)光強(qiáng)度. 將檢測(cè)所得不同樣本DNA的發(fā)光強(qiáng)度代入根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)含量DNA的發(fā)光強(qiáng)度所作的回歸方程，分別計(jì)算出其相應(yīng)的DNA濃度. 如果樣本發(fā)光強(qiáng)度超過標(biāo)準(zhǔn)DNA發(fā)光強(qiáng)度范圍，則將樣本稀釋后再進(jìn)行定量，直到所測(cè)值在標(biāo)準(zhǔn)濃度范圍內(nèi). 每次對(duì)同一血漿樣本檢測(cè)3次，取其平均值.

1.2.4腫瘤組織DNA的提取取約0.5 g冷凍組織立即放入液氮中磨碎成粉末狀， 加入到10倍體積的DNA抽提緩沖液中，邊加邊搖，混勻后置于50℃水浴1 h，再加蛋白酶K至終濃度為100 mg/L放入50℃水浴3 h，根據(jù)水解情況確定是否再加. 全溶解后加蛋白酶(終濃度20 mg/L) 37℃水浴1 h， 以等體積的飽和酚來回輕輕顛倒10 min， 4000 r/min離心10 min， 吸取上清至另一塑料管中，然后以酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)及氯仿∶異戊醇(24∶1)比例各抽提一次. 加1/10體積的3 mol/L乙酸鈉及2~2.5倍體積的冰乙醇沉淀DNA，然后用700 mL/L (V/V)乙醇洗滌DNA 3次，室溫下干燥，加適量TE溶解. DNA -20℃下保存， 以作為模板DNA擴(kuò)增.

1.2.5引物設(shè)計(jì)引物序列： U 上游 5′TTA TTA GAG GGT GGG GTG GAT TGT 3′，下游 5′CAA CCC CAA ACC ACA ACC ATA A 3′； M上游 5′TTA TTA GAG GGT GGG GCG GAT CGC 3′，下游 5′GAC CCC GAA ACC GCG ACC GTA A 3′; 其中U為非甲基化引物，M為甲基化引物.

1.2.6DNA甲基化修飾和純化取己提取的血漿或腫瘤組織DNA 50 μL， 加入50 μL 0.2 mol/L NaOH， 于37℃變性10 min， 加入10 mmol/L對(duì)苯二酚30 μL， 再加入520 μL 3 mol/L NaHSO3， 50℃水浴16 h進(jìn)行甲基化修飾， 水浴完畢后準(zhǔn)備純化DNA. 甲基化修飾后的DNA采用Wizard DNA Purification Resin(Promega公司) 純化試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒操作步驟進(jìn)行.

1.2.7半巢式甲基化特異性PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)體系: Taq DNA聚合酶25 μL， 模板DNA 2.5 ng， 引物1 (20 μmol/L) 1 μL， 引物2 ( 20 μmol/L) 1 μL， 200 μmol/L dNTPs 1 μL， 滅菌蒸餾水加至50 μL. PCR反應(yīng)條件: 95℃ 12 min; 95℃ 45 s， 60℃ 45 s， 72℃ 60 s共35個(gè)循環(huán) ; 72℃延長(zhǎng)10 min.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理: 全部資料用SPSS 11.0軟件分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，計(jì)量資料采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2結(jié)果

2.1血漿循環(huán)DNA濃度的檢測(cè)乳腺癌患者為（65.0±45.3） μg/L， 乳腺良性病變患者(19.0±9.5) μg/L， 健康自愿者(13.0±7.3) μg/L. 乳腺癌患者血漿循環(huán)DNA濃度顯著高于乳腺良性病變患者和健康自愿者，差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性(P<0.05).

2.2血漿循環(huán)DNA濃度作為乳腺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)的敏感度及特異度應(yīng)用受試者工作特性曲線(ROC)對(duì)乳腺癌患者組和兩對(duì)照組(乳腺良性病變組、健康自愿者組)進(jìn)行了分析. 采用19 μg/L作為診斷乳腺癌的臨界值， 結(jié)果顯示在健康人群中檢測(cè)乳腺癌的敏感度為95.1%， 特異度為88.9%， ROC曲線下面積(AUC)為0.946，95%CI為0.876~0.983 (圖1). 采用22 μg/L作為診斷乳腺癌的臨界值， 結(jié)果顯示在乳腺良性病變?nèi)巳褐袡z測(cè)乳腺癌的敏感度為93.4%， 特異度為66.7%， AUC為0.845， 95%CI為0.756~0.912 (圖1).

2.3乳腺癌患者血漿循環(huán)DNA p16基因5′ CpG島甲基化狀態(tài)改變的檢測(cè)為了證實(shí)血漿腫瘤循環(huán)DNA的特性，我們對(duì)61例乳腺癌患者血漿循環(huán)DNA的p16基因5′ CpG島甲基化狀態(tài)變化進(jìn)行了檢測(cè). 半巢式甲基化特異性PCR分析結(jié)果顯示: 61例乳腺癌患者血漿循環(huán)DNA有27例p16基因5′ CpG島甲基化， 甲基化率44.3%， 其相應(yīng)的腫瘤組織DNA有28例p16基因5′ CpG島甲基化， 甲基化率46.2%， 兩者檢出率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P>0.05). 血漿循環(huán)DNA具有腫瘤特性的相關(guān)基因.

3討論

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，治療上早期診斷是一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié). 血中游離DNA和p16基因5′ CpG島甲基化的檢測(cè)為乳腺腫瘤的早期診斷提供了一種新的簡(jiǎn)便途徑.

已證實(shí)腫瘤患者血清DNA水平大大高于正常人［8-9］. 研究表明乳腺癌在發(fā)生過程中除DNA序列改變外，DNA甲基化的表遺傳性的改變?cè)缬趷盒员硇偷某霈F(xiàn)并且具有腫瘤的獨(dú)特性，啟動(dòng)子的高甲基化是抑癌P16基因在乳腺腫瘤中失活的機(jī)制之一. 本實(shí)驗(yàn)中61例乳腺癌患者血漿循環(huán)DNA及其相應(yīng)的腫瘤組織DNA甲基化檢出率分別為44.3%和46.2%， 兩者檢出率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P>0.05). 這證明p16基因5′ CpG島甲基化狀態(tài)具有腫瘤特異性，并且循環(huán)血中DNA和腫瘤組織中表達(dá)的基因一致.

本實(shí)驗(yàn)我們采用SYBR green I熒光染色法研究了不同組別血漿循環(huán)DNA的濃度. 結(jié)果顯示: 乳腺癌患者血漿循環(huán)DNA濃度（65.0±45.3） μg/L顯著高于乳腺良性病變患者(19.0±9.5) μg/L和健康自愿者(13.0±7.3) μg/L，差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性(P<0.05). 上述結(jié)果表明， 與正常對(duì)照組相比，惡性腫瘤患者循環(huán)DNA水平明顯升高， 循環(huán)DNA的含量檢測(cè)對(duì)腫瘤的診斷有一定的價(jià)值，其可能是腫瘤診斷的一個(gè)重要生物學(xué)指標(biāo).

本研究我們構(gòu)建了ROC曲線來評(píng)價(jià)循環(huán)DNA定量的敏感度及特異度，以此確定診斷乳腺癌的截?cái)?cutof)值. 結(jié)果發(fā)現(xiàn): 分別采用19 μg/L和22 μg/L作為正常人群組和具有高危性的乳腺良性病變患者組診斷乳腺癌的臨界值時(shí)， 敏感度及特異度各不相同. 因此， 循環(huán)DNA檢測(cè)適合作為臨床診斷乳腺癌指標(biāo)，但在不同受試人群中需根據(jù)檢查目的使用不同的截?cái)?cutoff)值.

以循環(huán)DNA為基礎(chǔ)的核酸分析對(duì)于探測(cè)腫瘤特異的細(xì)胞外DNA， 是一種新的、有潛在價(jià)值的癌癥檢測(cè)和監(jiān)測(cè)方法. 當(dāng)然，迄今仍沒有足夠的證據(jù)顯示［10］，細(xì)胞外核酸能代替細(xì)胞內(nèi). 但循環(huán)中的癌基因或相關(guān)DNA的檢測(cè)對(duì)于癌癥的篩選、診斷和監(jiān)測(cè)有重要的意義， 血漿腫瘤循環(huán)DNA有可能成為一種新的惡性腫瘤標(biāo)志物.